2018, Vol. 38 
2. 山西大学化学化工学院 太原 030006;
3. 山西中医药大学基础医学部, 太原 030619
2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
3. Basic Medical College, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030619, China
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，属常用补益类中药，自1977年始，收载于《中华人民共和国药典》。黄芪主要含有多糖、三萜皂苷、异黄酮等活性成分[1]。黄芪皂苷Ⅳ即黄芪甲苷，自1995年版《中华人民共和国药典》收载入黄芪定量分析项。在供试品溶液制备中，水饱和正丁醇萃取后均存在氨试液洗涤即碱处理步骤，一方面可以除去黄酮、糖等酚类和碱溶性物质，即达到除杂的目的，另一方面也可以促进黄芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、乙酰黄芪皂苷Ⅰ转化为黄芪皂苷Ⅳ[2～5]。
除氨试液外，氢氧化钾、氢氧化钠及碳酸氢钠在黄芪皂苷Ⅳ含量测定中的应用，国内多个课题组进行了研究。如张金红等[6]采用回流提取液碱水解的方法发现，回流提取液中加入0.1 mol·L-1的氢氧化钠，室温静置2 h，黄芪甲苷收率可提高16.4倍；江燕等[7]发现，无机碱的效果不如有机碱，氨试液可以有效除杂并获得较高的黄芪皂苷Ⅳ收率；覃红萍等[8]研究表明，直接对药材进行碱处理，黄芪皂苷间的转化更彻底；Chu等[9]研究发现，黄芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、乙酰黄芪皂苷Ⅰ和丙二酰黄芪皂苷Ⅰ在酸性溶液中稳定，中性时丙二酰黄芪皂苷Ⅰ部分转化为黄芪皂苷Ⅰ，碱性条件下黄芪皂苷Ⅳ为主要转化产物。此外，乙酰和丙二酰黄芪皂苷Ⅰ在碱性溶液中部分转化为黄芪皂苷Ⅱ，黄芪药材中还存在着未知的皂苷类组分在碱性溶液中可以转化为黄芪皂苷Ⅳ。以上研究对于理解碱处理在黄芪质控指标—黄芪皂苷Ⅳ含量测定中应用的科学内涵具有重要意义，但研究用药材用量均超过1.0 g，不适用于微量样本的定量分析。
鉴于目前药材品质形成研究多以组培或盆栽材料展开，样品量小，采用上述方法具有一定的局限性，因此很有必要建立一种黄芪皂苷Ⅳ的微量分析方法。此外，作为黄芪药材中的主要异黄酮成分及质控指标，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷是否也存在着酰基化修饰？碱处理是否也影响着两者的转化？基于以上考虑，本研究拟对碱处理在微量黄芪含量测定中的应用进行再研究，以满足微量材料评价药材品质、黄芪药材品质形成及其机制研究等工作的需要。
1 材料与方法 1.1 材料2年生黄芪药材：2016年10月采自山西省浑源县官儿乡，由山西医科大学药学院高建平鉴定为蒙古黄芪（A.mongholicus），室温条件下运回实验室后，阴干，用于方法学优化与UPLC-Q-TOF-MS分析。
样品经粉碎后，过2号筛，保存于干燥器中备用。
1.2 化学试剂黄芪皂苷Ⅳ（纯度≥98%）购自上海永恒生物科技公司；毛蕊异黄酮葡萄糖苷（纯度≥98%）、芒柄花苷（纯度≥98%）购自江西本草天工科技有限责任公司；黄芪皂苷Ⅰ（纯度≥98%）、异黄芪皂苷Ⅰ（纯度≥98%）、黄芪皂苷Ⅱ（纯度≥98%）、异黄芪皂苷Ⅱ（纯度≥98%）、异黄芪皂苷Ⅳ（纯度≥99%）购自北京融诚鑫德科技发展有限公司。甲醇、乙腈和甲酸均为TEDIA色谱纯，水为超纯水。其余试剂为普通分析纯。
1.3 碱处理体系的优化与考察 1.3.1 对照品溶液的制备取黄芪皂苷Ⅳ对照品适量，精密称定，甲醇溶解并定容，配制成1.07 mg·mL-1的对照品储备液。采用类似方法，配制得黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷对照品储备液，浓度分别为0.12、0.11、0.14、0.10、0.13、1.039和1.051 mg·mL-1，4℃保存备用。
1.3.2 供试品溶液的制备取样品0.15 g，精密称定，用30倍体积的70%乙醇浸泡1 h后超声（40 kW）提取1 h，4 500 r·min-1离心10 min，收集上层清液；药渣用相同体积的70%乙醇再提取1次，4 500 r·min-1离心10 min，合并滤液；旋转蒸发至干，甲醇溶解并定容至2 mL。
碱处理体系中，70%乙醇溶液由无水乙醇、氨水和超纯水制得；先量取一定体积的无水乙醇，再按比例加入氨水，最后用超纯水补足体积。其中的氨水浓度分别为2%、4%和6%，以不加氨水者作为对照。利用优化的氨水浓度，进行后续方法学考察和含量测定。
1.3.3 分析条件 1.3.3.1 黄芪皂苷Ⅳ色谱条件：Agilent-1290 UHPLC色谱仪，BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色谱柱，流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min，85%A→40%A；3～4 min，40%A→20%A；4～5 min，20%A→40%A；5～7 min，40%A→85%A；7～9 min，85%A）；流速：0.2 mL·min-1；进样量：3 μL，柱温：30 ℃。
质谱条件：AB SCIEX 3200 QTRAP质谱系统（ABI，美国）、电喷雾离子源，正离子模式下检测；离子喷雾电压：5.5 kV；涡轮喷射温度：500 ℃；载气：氮气；雾化器：0.34 MPa；气帘气：0.24 MPa。多反应监测模式定量分析：m/z：786.1（[M + H]+）→473.4（[M-C6H10O5-H2O-C5H9O4+ H]+）；优化DP：60；CE：25；CXP：3。
1.3.3.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷按照2015年版《中华人民共和国药典》一部黄芪含量测定项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱条件[11]，采用RIGOL高效液相色谱仪：L-3500紫外-可见检测器、L-3400柱温箱、L-3320自动进样系统、L-3200高压输液泵和L3100溶剂组织器（北京普源精电科技有限公司）进行含量测定。
1.3.4 方法学考察 1.3.4.1 线性关系取“1.3.1”项下溶液，甲醇稀释为系列浓度，按设定方法依次进样，分别以黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量与峰面积进行线性回归。
1.3.4.2 精密度、稳定性和重复性精密吸取线性浓度低、中、高对照品溶液，24 h内连续进样6次，进行精密度考察。
取供试品溶液，室温放置，分别在0、2、4、8、16和24 h按“1.3.3”项下方法测定，以考察方法的稳定性。
取同一药材样品6份，分别制备供试品溶液，按“1.3.3”项下只有条件没有方法测定，以考察方法的重复性。
1.3.4.3 加样回收率精密称定已进行含量测定的黄芪样品，分别加入高、中、低3个水平的对照品溶液，每个水平3份，按“1.3.3”项下方法测定，计算回收率和RSD。
1.3.5 UPLC-Q-TOF-MS参照文献[7]色谱与质谱条件，根据对照品的保留时间和特征离子碎片，进行对照与碱处理样品中相关化合物的指认；根据精确相对分子质量和特征离子碎片信息，进行未知化合物和其他有关化合物的指认。
1.3.6 数据分析数据以平均值±RSD的形式表示。利用软件Graphpad Prism 7.0进行差异显著性分析，阈值设定为p < 0.05，p < 0.01为极显著差异。
2 结果 2.1 碱处理体系的优化文献报道，无机碱的效果不如有机碱，氨试液可以有效除杂并获得较高的黄芪皂苷Ⅳ转化率。因此，选取2%、4%、6%氨水浓度的70%乙醇进行提取，以不含氨水的提取液作为对照，结果见表 1。从表中数据可以看出，4%和6%处理组黄芪皂苷Ⅳ含量明显高于对照和2%处理组。为了考察氨水浓度对黄酮类化合物的影响，采用HPLC法测定了毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量（见表 1）。结果表明，所有氨水组两者含量均显著高于对照。综合氨水浓度对三者含量的影响，选取含4%氨水的70%乙醇进行后续方法学考察。
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表 1 氨浓度对黄芪药材中黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷收率的影响 Table 1 Effects of different concentrations of ammonium hydroxide on the yields of astragaloside Ⅳ, calycosin-7-O-β-D-glucoside and ononin in Astragali Radix |
精密量取“1.3.1”项下各储备液，配制得系列溶液。以对照品含量为横坐标，峰强度（或面积）为纵坐标，绘制得标准曲线。其中黄芪皂苷Ⅳ的回归方程：
Y=5.641X+737.3 r2=0.995 1
线性范围为10.70～85.60 μg·mL-1，以信噪比S/N=3计算检测下限（LOD），以信噪比S/N=10计算定量下限（LOQ），LOD和LOQ分别为0.309和1.031 μg·mL-1。毛蕊异黄酮葡萄糖苷的回归方程：
Y=2.790X+11.90 r2=0.999 7
线性范围为1.039～72.73 μg·mL-1，LOD和LOQ分别为0.021和0.071 μg·mL-1。芒柄花苷的回归方程：
Y=3.889X+2.645 r2=0.999 8
线性范围为1.051～73.57 μg·mL-1，LOD和LOQ分别为0.017和0.057 μg·mL-1。
2.2.2 精密度、稳定性和重复性有关结果见表 2。从表中数据可以看出，连续进样6次，测得对照品的RSD最大为2.8%，最小仅为0.2%，说明仪器精密度良好。
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表 2 精密度考察结果 Table 2 Results of the precision test |
供试品溶液放置于室温条件下，在24 h内不同时间点测定，黄芪皂苷Ⅳ峰强度、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷峰面积的RSD分别为2.9%、1.4%和1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
取同一批次药材6份，制备得供试品溶液，测得三者的RSD分别为2.6%、1.3%和2.2%，提示该方法重复性良好，样品混合均匀。
2.2.3 回收率测定结果见表 3。从表中数据可以看出，黄芪皂苷Ⅳ回收率为102.8%～108.1%，RSD为4.8%～1.2%；毛蕊异黄酮葡萄糖苷回收率为86.3%～88.8%，RSD为0.87%～1.8%；芒柄花苷回收率为90.6%～92.3%，RSD为2.7%～5.6%。
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表 3 回收率考察结果 Table 3 Results of the extraction recovery test |
Chu等[9]研究表明，在碱性条件下，黄芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、乙酰黄芪皂苷Ⅰ和丙二酰黄芪皂苷Ⅰ均可转化为黄芪皂苷Ⅳ，乙酰黄芪皂苷Ⅰ和丙二酰黄芪皂苷Ⅰ部分转化为黄芪皂苷Ⅱ。此外，黄芪药材中还存在着未知的三萜皂苷，在碱性溶液中可以转化为黄芪皂苷Ⅳ。为了探究优化后碱处理体系中上述物质的转化特征，以不含氨水者为对照，采用UPLC-Q-TOF-MS技术，对同一批次样本进行了分析。
由于黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ及其异构体均存在20，24-环氧-9，19-环阿屯烷-3，6，16，25-呋喃苷元结构，在电喷雾-飞行质谱正离子模式下，存在质荷比为473.362（C30H49O4）及其系列缩水产物的特征离子碎片，如455.352（C30H47O3）、437.341（C30H45O2）和419.331（C30H43O）[12]。据此，对质荷比为473.362的离子流进行了提取，结果见图 1。从该图可以看出，碱处理导致色谱峰数量明显减少，但也可以观察到对照样本中不存在的色谱峰，如色谱峰1。根据对照品精确相对分子质量及特征离子碎片，对有关化合物进行了指认，具体信息见表 4。图谱对比分析表明，碱处理引起黄芪皂苷Ⅳ（No.6）响应明显增强，且还存在一未知化合物（No.7）向黄芪皂苷Ⅳ的明显转化及No.3色谱峰的完全转化。通过离子碎片分析发现，No.3色谱峰除具有黄芪皂苷Ⅳ特征碎片外，还具有947.517 5[M+H]+、969.500 6[M+Na]+、821.471 9[M+H-3Ac]+等离子碎片，提示该物质很可能为黄芪皂苷Ⅳ乙酰化产物。此外，碱处理还引起保留时间为5.261的未知化合物（No.4）响应增强，该化合物具有黄芪皂苷Ⅳ特征离子碎片。
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A.对照组（reference）B.碱处理组（alkali treatment） 图 1 碱处理对黄芪药材中具环黄芪醇结构化合物转化的影响 Figure 1 Effect of alkali treatment on the conversion of compounds containing cycloastragenol as a skeleton in Astragali Radix |
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表 4 基于UPLC-Q-TOF-MS的含酰基的有关化合物汇总 Table 4 The compounds containing acyl groups tentatively identified by UPLC-Q-TOF-MS |
就黄芪皂苷Ⅱ而言，碱处理导致黄芪皂苷Ⅱ与异黄芪皂苷Ⅱ（No.8和No.9）响应减弱或消失，提示黄芪皂苷Ⅱ转化不彻底。此外，碱处理还引起黄芪皂苷Ⅱ未知衍生物（No.10）的明显转化。该衍生物除具有黄芪皂苷Ⅱ的特征碎片外，还存在失去乙酰基团和环开裂形成的减小CO的离子碎片，具体信息见表 4。正、负离子模式下，碱处理样品中均未检测到黄芪皂苷Ⅰ及其异构体（No.11和No.12），提示优化后的碱处理体系中黄芪皂苷Ⅰ转化较为完全。
2.4 碱处理对潜在的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷酰基化产物转化的影响“2.1”项下结果表明，除黄芪皂苷Ⅳ外，碱处理还导致毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷收率显著增加。这种增加是否与两者酰基化产物在碱性条件下的脱酰基化作用有关？针对此，对样品中具有两者苷元结构特征的离子流进行了提取，结果见图 2和图 3。从图 2可以看出，除毛蕊异黄酮及其葡萄糖苷（色谱峰13）与（色谱峰15）外，还存在保留时间为2.966、[M+H]+为679.514 2、[M+Na]+为701.496 1、[M+HCOO]-为723.5016的色谱峰（No.14）。质谱分析表明，该化合物存在661.503 8[M+H-H2O]+、447.129 8[M+H-H2O-2Mal-Ac]+、285.075 9[M+H-H2O-2Mal-Ac-Glc]+及283.061 6[M-H-H2O-2Mal-Ac-Glc]-等离子碎片。对比图 2-A和2-B可以看出，该化合物在对照样品中的响应远高于碱处理组，提示该化合物很可能为丙二酰毛蕊异黄酮葡萄糖苷，该化合物在碱性溶液中不稳定，容易脱去酰基基团，且反应较为完全。
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A.对照组（reference）B.碱处理组（alkali treatment） 图 2 碱处理对含有毛蕊异黄酮苷元结构化合物转化的影响 Figure 2 Effect of alkali treatment on the conversion of isoflavon containing calycosin as aglycone in Astragali Radix |
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A.对照组（reference）B.碱处理组（alkali treatment） 图 3 碱处理对含有芒柄花苷苷元结构化合物转化的影响 Figure 3 Effect of alkali treatment on the transformation of structural with formononetin on Radix Astragali |
以芒柄花黄素即芒柄花苷苷元进行的色谱峰提取结果见图 3。从该图可以看出，负离子模式下，对照样品中明显存在着保留时间为4.172的色谱峰，碱处理后几乎观察不到，提示该化合物很可能存在酰基化修饰。质谱分析表明，该化合物存在643.405 8[M+H]+、517.134 9[M+H-3Ac]+、453.340 9[M+Na-3Ac-Mal]+、269.081 6[M+H-3Ac-Mal-Glc]+、1 370.657 0[2M+Mal]、1 238.615 4[2M-HCOOH]-、1194.590 9[2M-HCOOH-CO]-、1 108.554 6[2M-HCOOH-CO-Mal]-等离子碎片，提示该化合物中同时存在丙二酰基和乙酰基基团，应属芒柄花苷酰基化产物。鉴于样本中没有检测到三萜皂苷丙二酰产物，而存在芒柄花苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷丙二酰产物，推测异黄酮化合物中的丙二酰基较为稳定，但相关推测还有待进一步研究确认。
3 讨论以微量黄芪样品为验药试材，以黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷作为评价指标，本研究首先建立了微量样品碱处理定量分析方法。在此基础上，采用UPLC-Q-TOF-MS技术分析了碱处理对具有环黄芪醇苷元结构化合物转化的影响，发现优化后体系中黄芪皂苷Ⅰ转化较为完全，黄芪皂苷Ⅱ部分转化，亦存在未知化合物的转化，此结果与Chu等[9]报道结果较为吻合。碱处理体系中具有毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷苷元结构色谱峰数量的减少，提示酰基化修饰亦存在于黄芪异黄酮化合物中。碱处理还引起未知化合物1和2的转化（见图 1与表 4）。尽管Chu等[13]发现，黄芪中存在8种黄芪皂苷丙二酰盐，但本研究在对照处理体系中未检测到丙二酰盐的存在，这可能与丙二酰黄芪皂苷在中性和碱性条件下不稳定有关。
通过体内外代谢研究，刘晓亚[14]发现黄芪皂苷Ⅳ易被水解，发生脱糖基反应，生成皂苷元环黄芪醇及其葡萄糖苷，以药理活性较强的环黄芪醇形式发挥作用，提示黄芪皂苷Ⅳ属黄芪药材中重要活性组分。就化学结构而言，乙酰黄芪皂苷Ⅳ、黄芪皂苷Ⅳ与黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ及其异构体均属达玛烷型三萜皂苷，区别仅在于黄芪皂苷Ⅳ结构中的葡萄糖残基中羟基基团的乙酰基数量与修饰位置[3～4]。换言之，上述物质应属黄芪皂苷Ⅳ衍生产物，即黄芪皂苷Ⅳ应属黄芪中多种达玛烷型三萜皂苷合成的重要骨架化合物（或前体），因此，可作为黄芪三萜皂苷合成与积累机制研究的指标化合物。此外，推测黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷很可能在异黄酮类物质合成中亦发挥着类似骨架化合物的作用，应用于黄芪类黄酮化合物合成与积累研究。
在植物体内，亚油酸经脂肪氧合酶、脂肪酸氢过氧化物裂解酶作用后即可形成正己醛，属植物氧脂类信号分子，不仅在植物防御应答中发挥着积极作用[15]，也参与植物特有气味或风味形成，是黄芪药材“豆腥气”主要成分之一[16]。优化后的碱处理体系将用于以后研究根施正已醛黄芪药材三个质控指标成分的含量测定。
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