任何分析检测的目的都是为了获得稳定、可靠和准确的数据，方法验证在其中起着极为重要的作用。药品质量标准中的分析方法验证（简称方法验证）是对标准中拟采用的分析方法是否能达到预期目的，或证明由分析方法误差而导致试验结果判断错误的概率是否在允许范围之内，而进行的科学证明。

各国药典^[1-3]的相关附录或通则，和国家药品审评中心《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》等^[4]，均对分析方法验证有原则性的规定，这些规定和国际协调会议（ICH）或ISO/IEC 17025的相应要求基本上相同^[5-6]。国内有不少学者^[7-11]就药品分析方法验证的概念、实质、内涵和适用性，以及如何进行方法验证进行了有益的讨论或探索，发表了一些有指导意义的文章，总结出方法验证的基本步骤、特征和要素，为药品分析方法建立和验证提供了指导。但对方法验证的内涵和涉及方法验证的要点少有阐述。在建立分析方法研究中，方法学验证方面还存在较多的问题，主要表现为：目的不明确，方案不合理，结果不可靠，结论不可行，验证内容流于形式或将方法建立过程与方法验证过程分割开来等方面。

本文以《中华人民共和国药典》2015年版四部通则（9101）的验证内容为主线，对方法学验证中的一些要点进行讨论，以期对药品质量标准方法的建立和验证提供帮助。

1 准确度

回收率试验是评价准确度最为常用、较为简便的方法之一。加样回收试验可用以下方式实现：①在空白辅料或阴性样品中加入对照品（标准品）或对照提取物制成模拟样品；②在待测样品中加入对照品（标准品）或对照提取物。依法测定上述样品，根据测定的总量、加入量和已知成分含量，计算百分回收率试验。

但是，在无法或无必要加样回收试验时，评价准确度可选用以下方式：①依法测定已知纯度的对照品或供试品；②将依法测定的结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较；③用该分析方法已求出的精密度、线性和专属性数据来评价或推算出准确度。

准确度是制备同一浓度（相当于100%浓度水平）的供试品，用至少平行6份测定结果进行评价，还是设计高、中、低3个不同浓度，每个浓度水平分别制备3份供试品溶液，用9个测定结果进行评价；应取决于样品性质和待测成分含量变化范围，即应在规定的浓度或量的范围内考察。

2 精密度

精密度系指在规定的条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。

所有的定量测定应考察方法的精密度。

精密度试验的设计原则同准确度，即浓度水平的设计应科学、合理和可靠，能覆盖供试品中待测成分含量可能变化的范围。

3 专属性

应注意专属性与选择性的区别。专属性是指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号。选择性是指在供试品中有其他组分共存时该分析方法对待测成分准确而专属的测定能力。选择性可对多种化学成分产生不同响应。但在实际工作中，很少有分析方法包括色谱分析方法，是真正体现专属性的，国际理论与应用化学联合会推荐专属性作为选择性的最终目标，旨在获得高选择性的分析方法^[12]。USP <1225> 参考ICH的定义，增加了一些国际机构倾向于使用的“选择性”一词，但保留专属性这个词，以用于那些具有完全选择性的方法。

因此，在考察一个分析方法的选择性时，应着重考虑杂质、降解产物、相关化合物以及制剂辅料等其他组分对被测药物测定的干扰。一般通过添加上述物质的样品与未曾添加的样品所得分析结果进行比较而确定。

由于对干扰的预测和认识程度的限制，实际检测中往往会遇到各种明确或不明确的干扰，如果干扰物质不能从被分析物中分离出来，或者不能被识别，那么干扰就会产生一定的影响。

鉴别反应可通过标记物或阳性质控和阴性对照的方法进行验证。

对于色谱法，峰响应信号是仅归因于分析物，还是同时含共存干扰物质的贡献，应经过充分、有效的验证。

（1）以分离度（试验）溶液试验，分离度应符合要求。

分离度（试验）溶液是用于验证所采用色谱方法分离度是否达到要求的测试溶液，常采用被分离组分的对照品或用鉴定色谱柱分离效能的指标性物质配制，也可采用供试品及其对照品强制降解[强光照射、高温、高湿、酸（碱）水解或氧化]的方法获得，也可用含有不同杂质含量的粗品以及降解产物混合，制成分离度（试验）溶液，在评价分离度的同时，还可用于色谱峰的峰定位。

（2）以不含被测成分的供试品（除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟处方，通常称阴性试样）试验。

（3）在共存物（或杂质）可获得的情况下，试样中可加入共存物，考察测定结果是否受干扰。对于多个共存物的测定，也可向试样中加入一定量的多个共存物，考察各共存物之间及与待测成分能否得到分离。

（4）在共存物如杂质或降解产物不能获得的情况下，或分离度试验溶液无法制备的情况下，测定可能含有共存物如杂质或降解产物的供试品，与用另一个经验证的方法或药典方法测定结果比较。含（限）量测定方法可比对不同方法的结果，杂质检查可比对检出的杂质个数。

（5）用光二极管阵列检测器和质谱检测器进行峰纯度检查。

正确理解分离度的含义并合理地运用于实际色谱分析中，对验证方法的专属性有着重要的意义。理论上可以证明，对于服从正态分布的等高的相邻两色谱峰，一般来说，当R＜1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，可认为已完全分离，也称为基线分离^[13]。无论是定性鉴别还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与相邻成分色谱峰间有较好的分离度。

《中华人民共和国药典》2015年版规定分离度一般应不小于1.5^[14]。但是，相邻色谱峰均服从正态分布且又等高是一种理想状态，在多数情况下并非如此。难分离物质的分离度大小受色谱过程中2种成分热力学和动力学的综合影响，影响谱带展宽的传质和扩散因素的讨论是基于线性色谱，实际上遇到的是非线性色谱，造成峰“峰拖尾”和“伸舌头”现象，使峰展宽，对峰的基线宽度的影响等。如测定化学药的有关物质时，供试品溶液的浓度一般比对照溶液或对照品溶液至少要高出100倍，由于浓度过高或非线性色谱等原因，色谱峰常出现拖尾不服从正态分布的现象，且由于主成分与有关物质的量相差很大，使它们的峰不等高；又如测定中药及中成药时，供试品中基质复杂且所含的各组分含量存在差异，色谱峰峰形会不同程度地偏离正态分布，峰响应值也不可能相同或相近。因此，在一些品种的液相色谱分析实例中，分离度为1.5时不一定能满足基线分离且无干扰的要求。分离度应为多少方可使待测成分峰不受相邻色谱峰的干扰，实际上是随待测成分的色谱行为和浓度，供试品体系的复杂程度以及检测所要达到的目的不同而异。如《中华人民共和国药典》2015年版二部中，已酮可可碱的有关物质测定项下规定，茶碱峰与咖啡因峰的分离度应大于4^[15]50；头孢地尼的含量测定项下规定，头孢地尼与其相对保留时间0.9和1.2处杂质峰（前后）的分离度均应不小于1.2^[15]245。

还应注意：在多组分测定某些品种有关物质时，除对相邻峰的分离度予以规定外，对某2个非相邻色谱峰的分离度也予以规定^[15]381。这时，常常要求分离度不小于10或者是更大值，其目的可能是通过限定这两个成分色谱峰的分离度，以保证那些保留时间处于这2个成分峰之间的成分得以分离，且不干扰这2个成分的测定。

4 检测下限（limit of detection，LOD）和定量下限（limit of quantitation，LOQ）

建立微量分析方法时，均应通过测试确定方法的检测限和方法的定量限。定量限的确定值应具一定准确度和精密度。《中华人民共和国药典》提供了确定检测限和定量限的3种常用方法（直观法、信噪比法和斜率法），供实际工作中选择。

需要注意的是，检测限一般有仪器检测下限、分析方法检测下限之分^[16]。仪器检测下限（instrument detection limit，IDL）是指分析仪器能检出与噪音相区别的小信号的能力，是分析仪器能检出被分析物的最低量或浓度，是与信噪比有关的指标^[17]。仪器检测下限不考虑任何样品制备步骤的影响，因此，其值总是比方法的检测下限要低，一般不用于最终的数据报告，而主要用于数据的统计分析，以及不同仪器的性能比较。

方法检测下限（method detection limit，MDL）不但与不同仪器检测限有关，而且决定于方法全部流程的各个环节，如取样，分离富集，测定条件优化等，即分析者、环境、样品性质、不同仪器等对检测限也均有影响，实际工作中应说明获得检测限的具体条件，还决定了方法全过程带来的误差总和。方法检出下限是衡量不同的实验室、分析方法和分析人员效能的一个相对标准，是分析化学中质量控制的一个重要概念和参数。方法检出下限一般需要在最终的数据报告中提供，用于表示该数据的不确定性和局限性^[19]。

在实际工作中，不建议将仪器检测下限直接作为方法检测下限。在微量或痕量分析时，如根据估算的仪器检测下限确定方法检测下限，应考虑多台仪器能达到的水平，还应考虑样品处理时的稀释或浓缩倍数等因素。

样品检测下限系指相对于空白可检测的样品的最小含量。只有当空白含量为零时，样品检测下限才等于方法检测下限。实际上样品检测下限可能要比方法检测下限大得多，样品检测下限比方法检测下限更有意义，只是在实际工作中不被人们所认知和采用。

方法应有足够的灵敏度，如测定有关物质时，理想方法的检测下限和定量下限应分别小于控制限度值的1/30和1/10，如确实达不到这一要求，可适当放宽，但必须使定量下限小于报告下限。

5 线性

应在规定的范围内考察线性关系。可用同一对照品（或原料药）储备液经精密稀释，或分别精密称取对照品（或原料药），制备不少于5个不同浓度水平的系列对照品溶液的方法进行测定。以测得的响应信号对被测物的浓度作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。或者可采用描述浓度-响应关系的非线性模型。

一是线性范围要足够宽，以保证供试品溶液中待测成分的浓度（或量）落在线性范围内，且最好处于线性曲线的中间部分；二是线性范围最低点的浓度不得低于方法的定量下限。

对于常量测定，如化学药的含量测定，线性试验可接受的标准为：回归曲线的相关系数（r）不得小于0.998，Y轴截距应在100%响应值的2%以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%；对于微量测定，如化学药的有关物质测定，线性试验可接受的标准为：回归曲线的相关系数（r）不得小于0.990，Y轴截距应在100%响应值的25%以内，响应因子的相对标准差应不大于10%^[7]。

6 范围

分析方法验证中的范围是指具有一定精度和准确度的被测物质上限及下限量（浓度）之间的领域。验证时，设计范围一般为标准中规定值的±20%左右，如样品性质和待测成分含量变化范围较大，应在与之相应的范围如规定值的±50%甚至更宽的范围进行准确度、精密度及线性关系的验证。

7 耐用性

缺乏耐用性的方法很难称之为好方法，不论建立的是化学分析方法还是仪器分析方法，从供试品制备起，耐用性考察应贯穿方法建立全过程。

7.1 ICH

在分析方法建立过程中需要对耐用性进行考察，如果测定结果对分析的变动敏感时，应该对分析条件进行适当并说明注意事项^[5]。

7.2 《中华人民共和国药典》

耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测定条件要求苛刻，则应在方法中写明，并注明可以接受变动的范围，可以先采用均匀设计确定主要影响因素，再通过单因素分析等确定变动范围。

《中华人民共和国药典》2015年版列出供试品制备、高效液相色谱法和气相色谱法中典型的变动因素。验证方法耐用性，首先需要考虑各个实验室不同实验环境（包括温湿度条件）、不同分析人员、不同仪器（包括同一厂家不同规格仪器）、不同厂家的试剂和不同柱子（不同批号和/或供应商）等，其次需要考虑方法本身的参数波动的影响，如流速、温度（柱温、进样口和检测器温度）、检测波长、固定相、流动相组成、pH变化等，最后还应包括分析样品取样量、溶液的稳定性、样品处理方法和时间、流动相的影响、流动相组分、滴定剂的浓度、指示剂用量及颜色影响等。

液相色谱法应用中，一般允许^[18]小组分流动相（≤50%）比例变化±30%（相对于自身），但各组分变化不得超过±10%（绝对值）；缓冲盐浓度变化±10%；流动相pH变化±0.2；流速变化±50%；柱温变化±10 ℃。

经试验，测定条件小的变动应能满足系统适用性试验要求，以确保方法的可靠性。

8 方法建立和验证中的其他要点 8.1 校正因子的验证

校正因子广泛应用于各种药品检测方法中。对色谱方法而言，校正因子是指单位质量参照物质的色谱响应与单位质量待测物质（或成分）的色谱响应的比值，其本质是用参照物质的色谱响应校正待测物质的色谱响应。色谱校正因子法可用于化学药有关物质的测定和中药材及其复方制剂中多指标成分的测定，以选定的参照物质的色谱响应值对待测成分的色谱响应值进行校正。参照物质又称为参比物质或替代物；通常以主成分作为参照物质，也可选择其他成分或加入的任一物质作为参照物质。

如对多指标成分定量时，采用各成分的对照品外标法，存在着对照品难以获得、检测成本高的缺点，通过建立各成分间的校正因子，用1个对照品可同时测定多个成分的含量，这一方法常被称为替代对照品法^[19]，在中药多组分测定中，又被称为一测多评法（QAMS，quantitative analysis of multi-components by single-marker）^[20]。

校正因子本身就是相对值。对校正因子的验证是通过对待测物质和参比物质的色谱响应（值）的准确度、精密度等指标的验证来间接实现的。例如，在确定有关物质测定中的校正因子时，应分别评价待测杂质和主成分的色谱响应的准确度、精密度、检测限、定量限、线性、范围以及耐用性等，在完成上述评价的前提下，对校正因子的验证实际上已实现，没有必要也无法进行另行的验证。

要保证校正因子的重复性。校正因子的重复性很大程度上取决于方法的耐用性，其耐用性必须充分考察，特别是柱温、检测波长、流动相组成、流动相pH等变化的影响。

8.2 实验溶液的制备

为减少溶剂峰与色谱峰的畸变，应尽可能用流动相配制供试品与对照品溶液。在测定序列中，应进样稀释溶剂以排除是否对待测物质峰有干扰。

含量测定时，供试品溶液与对照品溶液浓度相同或相近，并确保在线性范围内，有足够的精密度。

在有关物质检查中，供试品溶液浓度一般在0.2~20 mg·mL^-1，应保证能准确定量检出0.1%的杂质；对照溶液或对照品溶液的浓度应与所关注的已知杂质限度相当。用主成分自身对照法时，对照溶液的浓度应与最大单个杂质限度相当，或与总杂质限度相当。

8.3 色谱方法系统适用性试验

系统适用性参数包括理论板数、分离度、灵敏度、重复性和拖尾因子等。应根据方法的特点，结合具体的检测目的，选择部分或全部参数进行试验评价。

为评价系统是否能充分满足测定要求，通常需制备系统适用性溶液，包括灵敏度溶液、分离度溶液等。灵敏度溶液用于验证所采用方法的检测灵敏度是否符合要求，用被测组分或主成分对照品配制，其浓度应不高于关注杂质限度的1/20，不低于检测下限^[21]。对杂质分析方法，一般认为方法的专属性（常用分离度溶液表征）、检测下限/定量下限和精密度是最重要的指标。色谱中最难分离物质对或与其相关的物质对的分离度和待测物的精密度通常是系统适用性试验的首选参数。对主成分含量分析方法，系统适用性试验的重点应是方法的重复性。对照品溶液通常用于验证方法的重复性。

分析方法验证是一个与分析方法建立和完善相联系的过程，建立方法就是对方法的各种参数不断地验证，验证就是对建立方法不断地完善，验证方法和建立方法都不是一个孤立的事件。