2018, Vol. 38 
珠子草（Phyllanthus niruri.Linn.）为大戟科叶下珠属植物，与黄珠子草、叶下珠均有区别[1-2]。珠子草主要含黄酮、木脂素、生物碱、鞣质等类多种成分，具有平肝清热、利水解毒之功效，用于肠炎、肝炎、痢疾、尿路感染、无名肿痛等疾病的治疗，具有明显的抗乙型肝炎病毒活性及对肝损伤的保护作用[3-13]，且毒副作用低，是一种值得深入开发的天然药物，其药效成分主要为多酚类化合物[14-17]。本研究建立高效液相色谱法同时测定珠子草中没食子酸、短叶苏木酚、柯里拉京、鞣花酸和芦丁的含量，各色谱峰分离良好，方法专属性强，结果准确，操作简便，可为珠子草质量标准的制订和提高提供依据。
1 仪器与试剂 1.1 仪器岛津LC-20A高效液相色谱仪，DAD检测器；Waters 2695-2996高效液相色谱仪；FA2004N电子分析天平（0.1 mg）（上海精密科学仪器有限公司）；XPE105电子分析天平（0.01 mg）（梅特勒托利多上海有限公司）。
1.2 试剂对照品没食子酸（批号110831-200302）、柯里拉京（批号111623-201002）、芦丁（批号100080-201106）购于中国食品药品检定研究院；短叶苏木酚（德尔塔林试剂公司，纯度＞98%，HPLC）；鞣花酸（天津一方科技有限公司，纯度＞98%，HPLC）。乙腈、甲醇（色谱纯）购于深圳西陇化工股份有限公司；双蒸水（自制），其他试剂均为分析纯。
珠子草药材（采自云南蛮耗），经兰州市第二人民医院李彩东博士鉴定为珠子草地上部分（Phyllanthus niruri Linn.）。
2 色谱条件及系统适用性试验 2.1 色谱条件色谱柱：菲罗门Gemini（250 mm×4.6 mm 5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，3%A→15%A；20～45 min，15%A→28%A；45～55 min，100%A；56～65 min，3%A），流速为0.8 mL·min-1，柱温为室温，检测波长270 nm，进样量10 μL。色谱图见图 1。
|
1.没食子酸（galic acid）2.短叶苏木酚（brervifolincaboxylic acid）3.柯里拉京（corilagin）4.鞣花酸（ellagic acid）5.芦丁（rutin） 图 1 对照品（A）、样品（B）及空白（C）的HPLC图谱 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A), sample(B)and negative sample(C) |
分别精密称取对照品没食子酸、短叶苏木酚、柯里拉京、鞣花酸和芦丁4.60、10.80、7.80、4.80和9.92 mg，置于同一25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取上述溶液5 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成没食子酸、短叶苏木酚、柯里拉京、鞣花酸和芦丁质量浓度分别为0.092、0.216、0.156、0.096、0.198 mg·mL-1的溶液，作为对照品储备液。
2.2.2 供试品溶液取珠子草药材粉末（蛮耗）约2.00 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，精密加入体积分数为50%的甲醇水溶液50 mL，称量，超声（功率500 W，频率40 kHz）提取30 min，放冷，再称量，加体积分数为50%的甲醇水溶液补足减失的量。取适量经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 线性关系考察分别精密量取混合对照品储备液0.2、0.5、1.0、2.5、3.5、5.0，置5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在“2.1”项色谱条件下进样20 μL分析。以对照溶液的质量浓度（X，mg·mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析计算，结果见表 1。
|
表 1 线性关系考察结果（n=5） Table 1 Results of linear relation |
取同一混合对照品溶液，在“2.1”色谱条件项下连续进样6次测定，记录峰面积。计算没食子酸、短叶苏木酚、柯里拉京、鞣花酸和芦丁峰面积的RSD分别为2.8%、2.0%、1.1%、0.65%、0.92%，表明仪器精密度良好。
2.5 重复性试验精密称取珠子草药材粉末（蛮耗）样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样分析。测得含量的RSD，没食子酸为1.0%，短叶苏木酚为1.6%，柯里拉京为0.56%，鞣花酸为1.7%，芦丁为1.1%。表明本方法重复性良好。
2.6 稳定性试验取同一供试品溶液，室温下放置0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”项色谱条件下进样分析，记录峰面积，计算没食子酸、短叶苏木酚、柯里拉京、鞣花酸和芦丁峰面积的RSD分别为0.91%、2.2%、1.5%、1.8%、2.1%。表明供试品溶液室温放置24 h内稳定。
2.7 加样回收率试验取已知含量的珠子草药材粉末9份，每份约1.0 g，精密称定。精密加入已知浓度的混合对照品溶液；按“2.2.2”项下方法制成低、中、高3个质量浓度的供试溶液，在“2.1”项色谱条件下进行分析，结果见表 2。
|
|
表 2 加样回收率实验结果 Table 2 Results of recovery rate test |
精密称取珠子草药材粉末5份，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，以外标法进行含量测定。结果见表 3。
|
|
表 3 样品中5个成分含量测定结果 Table 3 Results of content determination of sample |
本研究曾对70%、50%、30%甲醇水超声提取，提取时间、温度等提取方式和提取条件进行考察，发现70%和50%甲醇水超声提取在相对较短的时间内提取较为完全，综合实验条件和工作效率等因素，将提取条件定为50%甲醇水超声提取。
3.2 流动相的选择根据对色谱条件的摸索，考察了柱温、流速和梯度洗脱程序，最终确定了液相洗脱条件。
3.3 检测波长的选择根据二级管阵列检测器扫描全波长紫外图谱的结果和线性关系考察，最终确定在254 nm条件下，没食子酸、短叶苏木酚和鞣花酸在考察范围内都呈较好的线性关系，满足同时测定的需要，故确定254 nm为5个成分同时测定的检测波长。
3.4 色谱柱的选择分别考察了菲罗门Gemini 25 cm C18柱、迪马Ⅱ代25 cm C18柱和岛津15 cm C18柱对于珠子草中5个成分的分离效果，在既定的色谱条件下，发现菲罗门Gemini 25 cm C18柱已能实现较好的分离效果，峰形较好，故选用菲罗门Gemini 25 cm C18色谱柱。
3.5 小结采用高效液相色谱法对没食子酸、短叶苏木酚、柯里拉京、鞣花酸、芦丁进行含量测定研究，并通过方法学考察验证了分析方法的科学性，结果本方法具有良好的重复性和精密度（RSD＜3%），线性范围广，加样回收试验显示样品处理方法可行，样品稳定性好。本方法稳定准确，简便可行，可用于珠子草中以上成分的准确测定；运用本法同时测定样品中的成分，进样次数大幅减少，可大幅度缩短分析时间。
| [1] |
张忠廉, 唐德英, 张丽霞, 等. 珠子草遗传多样性的ISSR分析[J]. 中草药, 2011, 42(10): 2125. ZHANG ZL, TANG DY, ZHANG LX, et al. ISSR analysis on genetic diversity in Phyllanthus nriuri[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2011, 42(10): 2125. |
| [2] |
李彩东, 吴斌, 杨静. 珠子草的生药鉴定[J]. 中药材, 2000, 23(9): 522. LI CD, WU B, YANG J. Pharmacognostic identification of Phyllanthus niruri.Linn[J]. J Chin Med Mater, 2000, 23(9): 522. DOI:10.3321/j.issn:1001-4454.2000.09.006 |
| [3] |
梁云, 李彩东, 王信. HPLC同时测定珠子草中没食子酸、短叶苏木酚和鞣花酸的含量[J]. 中国现代应用药学, 2013, 30(8): 880. LIANG Y, LI CD, WANG X. Simultaneous determination of galic acid, brervifolincaboxylic acid and ellagic acid in Phyllanthus niruri.Linn.by HPLC[J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2013, 30(8): 880. |
| [4] |
仲英, 左春旭, 李风琴, 等. 叶下珠化学成分及其抗乙肝病毒活性的研究[J]. 中国中药杂志, 1998, 23(6): 363. ZHONG Y, ZUO CX, LI FQ, et al. Chemical component and anti-HBV activity research of Phyllanthus niruri.Linn[J]. China J Chin Mater Med, 1998, 23(6): 363. DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.1998.06.019 |
| [5] |
米志宝, 陈鸿珊, 张习坦, 等. 用嗜肝DNA病毒模型筛选抗病毒中草药[J]. 中国中药杂志, 1997, 22(l): 43. MI ZB, CHEN HS, ZHANG XT, et al. Screening of anti -virus Chinese herbal medicine by addicted to DNA virus model[J]. China J Chin Mater Med, 1997, 22(l): 43. |
| [6] |
贺浪冲, 岐琳, 吕居娴, 等. 陕西叶下珠药用开发研究:提取物体外灭活HBv抗原作用[J]. 西北药学杂志, 1996, 11(l): 11. HE LC, QI L, LÜ JX, et al. Study on medicinal development of Phyllanthus niruri in Shaanxi:anti -HBV antigen in vitro[J]. Northwest Pharm J, 1996, 11(l): 11. |
| [7] |
张美义, 白万明, 邹静, 等. 云南珠子草的调查及其抗病毒作用[J]. 中国中药杂志, 1992, 17(5): 259. ZHANG MY, BAI WM, ZOU J, et al. Investigation of Phyllanthus niruri in Yunnan Province and its antiviral effect[J]. China J Chin Mater Med, 1992, 17(5): 259. DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.1992.05.024 |
| [8] |
陈征途, 朱宇同, 方宏勋, 等. 三种叶下珠属植物在体外细胞培养中抗HBv作用的初步研究[J]. 广州中医药大学学报, 1997, 14(2): 102. CHEN ZT, ZHU YT, FANG HX, et al. Preliminary study on the anti -HBV effect of three species of Phyllanthus belonging to in vitro cultured cells[J]. J Guanghzou Univ Tradit Chin Med, 1997, 14(2): 102. |
| [9] |
徐大文, 马海伦, 任中原, 等. 苦味叶下珠抗乙型肝炎病毒的研究[J]. 天津医药, 1994(12): 717. XU DW, MA HL, REN ZY, et al. Anti-HBV research of Phyllanthus niruri[J]. Tianjin Med J, 1994(12): 717. |
| [10] |
刘庄, 傅希贤, 张乃临, 等. 中草药叶下珠不同品种和制剂体外抗乙型肝炎病毒的实验研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 1997, 11(3): 252. LIU Z, FU XX, ZHANG NL, et al. Experimental study on anti-hepatitis B virus in vitro of different varieties and preparations of Phyllanthus niruri[J]. ChinJ Exp Clin Virol, 1997, 11(3): 252. |
| [11] |
SHIN MS, KANG EH, LEE YI. A flavonoid from medicinal plants blokes hepatitis B virus antigen secrcetion in HBV-infected hepatocytes[J]. Anti Viral Res, 2005, 67(3): 163. |
| [12] |
陈压西, 郭树华, 张定凤, 等. 重庆麻鸭乙肝动物模型的建立及应用-21种中药抗鸭乙型肝炎病毒初筛的研究[J]. 肝脏病杂志, 1993, 1(2): 89. CHEN YX, GUO SH, ZHANG DF, et al. Study on Chongqing duck hepatitis B animal model establishment and application of -21 traditional Chinese medicine anti-hepatitis B virus screening[J]. J Liver Disease, 1993, 1(2): 89. |
| [13] |
米志高. 中草药抗鸭乙型肝炎病毒的效果[J]. 中西医结合肝病杂志, 1994, 4(4): 24. MI ZG. Efficacy of Chinese herbal medicine against duck hepatitis B virus[J]. Chin J Integrated Tradit West Med Liver Diseases, 1994, 4(4): 24. |
| [14] |
陈压西, 郭树华, 张定凤, 等. 不同产地叶下珠及其联合用药抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究[J]. 中国中西医结合杂志, 1995, 15(4): 225. CHEN YX, GUO SH, ZHANG DF, et al. Experimental study on from Phyllanthus different areas and their combination on duck hepatitis B virus[J]. Chin J Integrated Tradit West Med, 1995, 15(4): 225. DOI:10.3321/j.issn:1003-5370.1995.04.013 |
| [15] |
邓学龙, 朱宇同, 郭兴伯, 等. 先天和后天感染鸭乙肝病毒, 广州鸭外周血中病毒血症的动态比较及应用[J]. 广州中医药大学学报, 1999, 16(l): 56. DENG XL, ZHU YT, GUO XB, et al. Dynamic comparison and application of viremia in peripheral blood of ducks infected with duck hepatitis B virus(HBV)and acquired duck hepatitis B virus(HBV)and congenital or acquired infection(Guangzhou)[J]. J Guanghzou Univ Tradit Chin Med, 1999, 16(l): 56. |
| [16] |
蔡瑾, 梁敬珏. 叶下珠化学成分及药理作用研究概况[J]. 海峡药学, 2003, 15(1): 1. CAI J, LIANG JJ. Study of chemical constituents of Phyllanthus niruri and its pharmacological effects[J]. Strait Pharm J, 2003, 15(1): 1. DOI:10.3969/j.issn.1006-3765.2003.01.001 |
| [17] |
SHIN MS, KANG EH, LEE YI. Aflavonoid from medicinal plants blocks hepatitis B virus-e antigen secretion in HBV-infected hepatocytes[J]. Antiviral Res, 2005, 67(8): 163. |