2018, Vol. 38 
2. 广西国际壮医医院, 南宁, 543000;
3. 广西梧州食品药品检验所, 梧州 543002
2. Guangxi International Zhuang Medicine Hospital, Nanning 543000, China;
3. Guangxi Wuzhou Institutes for Food and Drug Control, Wuzhou 543002, China
壮骨伸筋胶囊是长春中医学院附属医院骨科主任、全国著名骨科专家刘柏龄教授总结多年的临床经验钻研出来的处方，是目前治疗骨质增生、腰椎病、四肢麻木、肩臂疼痛、颈椎病、风湿骨痛最理想的中药制剂之一[1]，由淫羊藿（君）、骨碎补（臣）、肉苁蓉（臣）、葛根（佐）、熟地黄、鹿衔草、鸡血藤、茯苓等15味中药组成。研究表明，淫羊藿苷具有抗神经元损伤、补肾壮阳、祛风壮骨、抗肿瘤等作用，临床上主要用于风湿肿痛、筋骨痰软、麻木拘挛以及更年期高血压症等病症[2-3]；松果菊苷具有显著的保护神经、保护肝脏、抗氧化、有助于改善学习记忆和调节人体免疫系统等药理作用[4-5]；柚皮苷具有抗病毒、镇静、镇痛、活血解痉等多种生物活性，同时具有明显的抗炎镇痛、抗氧化应激性、降血糖、降血脂等作用[6-8]；葛根素具有保护心血管系统、抑制骨吸收、保护心肌和脑神经等作用，临床上广泛用于预防及治疗糖尿病血管并发症和治疗骨质疏松等多种症状[9-10]。从药理作用和临床研究发现，这4个成分可以很好地代表壮骨伸筋胶囊药理作用的化学物质基础。
目前，对于壮骨伸筋胶囊的测定方法主要有高效液相色谱法[11]和双波长薄层扫描法[12]，样品处理方法主要采用超声波萃取法和索氏提取法，以甲醇为萃取溶剂，这2种提取方法存在耗时长、试剂用量大、提取溶液不完全、溶剂易挥发等缺点。快速溶剂萃取仪具有萃取时间短、溶解能力强、提取效率高、全自动控制、使用方便可靠、安全性良好等优势[13-14]。目前，ASE萃取法已在环境、医药、食品、农业和聚合物工业等领域得到广泛应用[15]。本研究采用ASE萃取仪，结合正交设计方法作为提取壮骨伸筋胶囊中淫羊藿苷、松果菊苷、柚皮苷和葛根素含量的前处理方式，提取时间耗时仅为普通提取方法的1/20。
查阅相关的文献[16-18]，使用ASE萃取法同时提取并同时测定壮骨伸筋胶囊中淫羊藿苷、松果菊苷、柚皮苷和葛根素的含量未见报道。壮骨伸筋胶囊含量测定的相关文献中大多仅测定其中1～2个成分，《中华人民共和国药典》2015年版也仅收载了淫羊藿苷的含量测定方法，难以更全面地评价制剂的质量。本文采用HPLC法同时测定了壮骨伸筋胶囊中君臣佐药材中的4个主要有效成分，使中药制剂质量评价与药理作用相呼应，对中药制剂质量评价更具有针对性，进而也提升了壮骨伸筋胶囊质量标准。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（带二极管阵列检测器，美国安捷伦公司）；ASE350快速溶剂萃取仪（美国Thermo Fisher公司）。
1.2 试药对照品葛根素（批号110752-201514，含量以95.5%计）、松果菊苷（批号111670-201505，含量以92.5%计）、柚皮苷（批号110722-201312，含量以94.7%计）、淫羊藿苷（批号110737-201516，含量以94.2%计）均购自中国食品药品检定研究院。壮骨伸筋胶囊（批号20150902、20150903、20150907、20160105、20160310、20160401、20160405、20161011、20161101、20161201）均购自当地药房；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品溶液精密称取对照品葛根素14.36 mg、松果菊苷10.15 mg和淫羊藿苷11.13 mg，分别置于10 mL量瓶中，对照品柚皮苷19.44 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得到葛根素质量浓度为1.371 4 mg·mL-1、松果菊苷质量浓度为0.938 9 mg·mL-1 mL、柚皮苷质量浓度为0.736 4 mg·mL-1 mL和淫羊藿苷质量浓度为1.048 4 mg·mL-1的对照品溶液。
2.1.2 供试品前处理本品研磨后，取0.5 g，精密称定，加入适量硅藻土，混匀后装入5 mL不锈钢萃取池中，在快速溶剂萃取仪设定条件下（萃取溶剂为甲醇、萃取温度100 ℃、萃取时间5 min、萃取次数2次）进行萃取，萃取完成后，用甲醇定容至25 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.1.3 阴性对照溶液按《中华人民共和国药典》2015年版壮骨伸筋胶囊项下处方制法分别制备不含肉苁蓉、淫羊藿、骨碎补、葛根的阴性样品，按“2.1.2”项下方法操作，分别制得缺肉苁蓉、缺淫羊藿、缺葛根、缺骨碎补的阴性对照溶液。
2.2 色谱条件及系统适应性试验色谱柱：Phenomenex Kintex C18柱（4.6 mm×100 mm，2.6 μm）；以乙腈（A）和0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱：0～5 min，12%A→15%A；5～8 min，15%A→25%A；9～13 min，25%A→30%A；流速0.5 mL·min-1；检测波长290 nm；进样量3 μL；柱温30 ℃。在上述色谱条件下，分别准确吸取相同体积的供试品、对照品和阴性样品溶液依法测定，记录色谱图，结果表明，供试品中各组分均达到基线分离（R > 1.5），阴性对照无干扰，理论塔板数均大于4 000，见图 1。
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1.葛根素（puerarin）2.松果菊苷（echinacoside）3.柚皮苷（naringin）4.淫羊藿苷（icariin） A.混合对照品（mixed reference substances）B.样品（sample）C.缺葛根阴性样品（sample without Puerariae Lobatae Radix）D.缺肉苁蓉阴性样品（sample without Cistanches Herba）E.缺淫羊藿阴性样品（sample without Epimedium Folium）F.缺骨碎补阴性样品（sample without Drynariae Rhizoma） 图 1 HPLC色谱图 Figure 1 HPLC Chromatograms |
以甲醇作为溶剂，采用正交试验，考察快速溶剂萃取仪参数中的萃取温度（A）、循环次数（B）和萃取时间（C）3个因素，选用L9（3×3）正交表对壮骨伸筋胶囊中葛根素、松果菊苷、柚皮苷与淫羊藿苷提取条件进行优化设计，正交试验结果分析见表 1，方差分析见表 2。
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表 1 正交试验结果分析 Table 1 Orthogonal test results |
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表 2 方差分析结果 Table 2 Variance analysis results |
从正交试验直观分析可以看出，温度对葛根素及淫羊藿苷的提取效率影响最大；萃取时间对松果菊苷的提取效率影响最大；循环次数对柚皮苷的提取效率影响最大，为了同时兼顾其他成分的提取效率，故均选取该因素中影响最多成分的最优条件。对比4种测定成分方差分析结果可知，温度对于淫羊藿苷的提取有统计学意义（P < 0.05）；各影响因素大小与直观分析一致，综合各因素最后得出最佳的提取方案为A2B2C1，即以甲醇为溶剂，在100 ℃的萃取温度下，循环次数2次，提取时间3 min的效果最佳。
2.4 线性关系考察准确吸取“2.1.1”项下溶液：葛根素0.8 mL、松果菊苷2 mL、柚皮苷0.8 mL和淫羊藿1 mL置5 mL量瓶，使用甲醇定容作为对照品储备液，再分别精密吸取对照品储备液0.2、0.5、1、0.5、1 mL，置10、10、10、2、2 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，按“2.2”项下色谱条件进行测定，以对照溶液浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析，求得回归方程；再分别吸取“2.1.1”项下溶液，逐步稀释，按照“2.2”项下色谱条件测定。取信噪比为3: 1的质量浓度为检出下限，取信噪比为10: 1的质量浓度为定量下限，结果见表 3，结果表明4个成分在各自范围内呈良好的线性关系。
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表 3 回归方程和线性范围 Table 3 Regression equation and linear range |
精密吸取按“2.4”项下的对照品储备液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测定各个对照品溶液的色谱峰面积，计算葛根素、松果菊苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为1.7%、1.5%、0.96%、1.5%，结果表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验精密吸取按“2.1.2”项下的同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、10、12 h按“2.2”项下色谱条件进样，记录相应的色谱峰面积，结果葛根素、松果菊苷、柚皮苷、淫羊藿苷峰面积的RSD分别为1.1%、1.3%、0.75%、1.2%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验取同一批样品（批号20150902）6份，各约0.5 g，精密称定，按”2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录相关的峰面积，结果样品中葛根素、松果菊苷、柚皮苷、淫羊藿苷的平均含量分别为1.520、2.146、0.355、0.919 mg·g-1，RSD分别为1.1%、0.64%、0.94%、1.6%，表明该方法重复性良好。
2.8 回收率试验精密称取已知含量的同一批样品（批号20150902）6份，每份0.25 g，分别加入（浓度1.371 4 mg·mL-1）葛根素0.3 mL、0.5 mL（浓度0.938 9 mg·mL-1）松果菊苷、0.2 mL（浓度0.736 4 mg·mL-1）柚皮苷和0.2 mL（浓度1.048 4 mg·mL-1）淫羊藿苷对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，在“2.2”项下色谱条件进样，计算葛根素、松果菊苷、柚皮苷、淫羊藿苷的平均回收率，结果见表 4。
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表 4 回收率试验结果（n=6） Table 4 Sample recovery test results |
精密称取10批样品各0.5 g，分别按“2.1.2”项下方法和“《中华人民共和国药典》壮骨伸筋胶囊含量测定”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，测定各个相应的样品溶液的峰面积，计算含量，结果见表 5。结果表明，本方法与《中华人民共和国药典》方法结果接近，ASE法前处理相比《中华人民共和国药典》法简便、省时，提高了样品的检测效率，具有较普遍的适用性。
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表 5 样品含量结果（mg·g-1，n=10） Table 5 Result of contents in sample |
本实验以淫羊藿苷、松果菊苷、柚皮苷和葛根素的含量为指标，采用甲醇为提取溶剂，分别考察了回流、超声、索氏和快速溶剂萃取4种提取方式，结果超声提取不完全，回流和索氏提取耗时长，步骤复杂，故最终选择快速溶剂萃取。同时考察了甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、水饱和正丁醇4种提取溶剂，结果甲醇对4种成分提取均较完全；摸索了D101型大孔树脂柱、聚酰胺柱和用乙醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇液液萃取等除杂方法，结果发现各种除杂方法对不同成分含量有不同程度的损失，考虑到按本文的色谱条件分离杂质峰不干扰各成分的检测，故不采用除杂处理。
考察了乙腈-0.2%醋酸水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-水3种洗脱条件，结果乙腈-水洗脱时松果菊苷峰形不好；使用乙腈-0.2%醋酸水时柚皮苷与杂质的分离较差；用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相时，淫羊藿苷、松果菊苷、柚皮苷和葛根素都具有较好的分离效果，故最终采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相。采用二极管阵列检测器检测，葛根素、松果菊苷、柚皮苷和淫羊藿苷分别在250、330、283和270 nm处有最大吸收，综合考虑4个波长下各成分的响应及杂质峰影响，最终选取290 nm为检测波长。
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