2018, Vol. 38 
2. 吉化集团公司总医院, 吉林 132021
2. The General Hospital of CNPC in Jilin, Jilin 132021, China
栀芩清热合剂由栀子、黄芩、甘草、淡竹叶、连翘、薄荷油共6味药材组成，主要用于治疗三焦热毒产生的发热，口渴，尿赤[1]，其中栀子有泻火除烦、凉血解毒、清利湿热的功效。栀子中主要活性成分有京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、绿原酸；黄芩中的活性成分有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素等，具有凉血解毒、清热燥湿的效果，主要治疗上呼吸道感染引起的肺炎、疮疥等病症；甘草中含有甘草酸，甘草性温，可以清热解毒、祛痰止咳，且可以调和各味中药[2]。栀芩清热合剂为《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版新收录的中药制剂，但只测定其中京尼平苷的含量，对其他成分未有规定，不利于整体控制药品质量，而有关栀芩清热合剂的含量测定和质量控制文献较少，都是单独测定其中黄芩苷的含量[3-5]，目前未见同时测定此药多种组分含量的报道。本文建立了高效液相色谱法同时测定京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素、绿原酸8个成分的含量，对于栀芩清热合剂的质量控制具有重要意义。
1 仪器与试剂 1.1 仪器岛津公司LC-20AT高效液相色谱仪，包括SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20A自动进样器、岛津LC-solution工作站；迪马科技有限公司DIKMA Platisil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；Millipore公司Synergy 185超纯水仪，昆山市超声仪器有限公司KQ-250DE型数控超声波清洗器。
1.2 试剂对照品京尼平苷酸（批号111828-201403，纯度≥97.4%）、京尼平苷（批号110749-201316，纯度≥97.6%）、黄芩苷（批号110715-200514，纯度≥93.5%）、汉黄芩苷（批号112002-201501，纯度≥98.5%）、甘草酸（批号110731-201418，纯度≥93.0%）、黄芩素（批号111595-201306，纯度≥98.5%）、绿原酸（批号110753-201415，纯度≥99.3%）均购自中国食品药品检定研究院，京尼平龙胆双糖苷（批号141120，纯度≥98%）购自成都普菲德生物技术有限公司；栀芩清热合剂（批号150901，160702，170301，广东万年青制药有限公司）。乙腈为色谱纯，水为超纯化水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品溶液取0.117 mg·mL-1的京尼平苷酸的对照品溶液0.7 mL，0.100 mg·mL-1的京尼平龙胆双糖苷对照品溶液0.5 mL，0.108 mg·mL-1的京尼平苷的对照品溶液1.5 mL，0.57 mg黄芩苷对照品，0.105 mg·mL-1的汉黄芩苷的对照品溶液0.2 mL，0.109 mg·mL-1的甘草酸的对照品溶液0.5 mL，0.119 mg·mL-1的黄芩素的对照品溶液0.5 mL以及0.5 mL的0.082 mg·mL-1的绿原酸对照品溶液，将其置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成含京尼平苷酸0.081 9 mg·mL-1、京尼平龙胆双糖苷0.005 mg·mL-1、京尼平苷0.016 2 mg·mL-1、黄芩苷0.057 mg·mL-1、汉黄芩苷0.002 1 mg·mL-1、甘草酸0.005 45 mg·mL-1、黄芩素0.005 95 mg·mL-1、绿原酸0.004 1 mg·mL-1的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液精密量取栀芩清热合剂1.25 mL，置25 mL量瓶中，加70%甲醇水至刻度，摇匀，滤过，称量，精密量取续滤液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇水至刻度，摇匀，即得供试品溶液[1]。
2.1.3 阴性样品溶液按处方分别制备缺少栀子、黄芩、甘草的阴性样品，按“2.2”项方法操作，即得阴性样品溶液。
2.2 色谱条件色谱柱：DIKMA Platisil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，10%A→16%A；20～30 min，16%A→40%A；30～50 min，40%A→80%A）；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：240 nm（京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素）、327 nm（绿原酸）；进样量：20 μL。在上述色谱条件下，各待测组分分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5 000。混合对照品溶液、样品溶液及各阴性样品溶液色谱图见图 1、图 2。
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1.京尼平苷酸（geniposidic acid）2.京尼平龙胆双糖苷（genipin 1-gentiobioside）3.京尼平苷（geniposide）4.黄芩苷（baicalein）5.汉黄芩苷（wogonoside）6.甘草酸（glycyrrhizic acid）7.黄芩素（baicalein） 图 1 混合对照品（A）、样品（B）、不含栀子的阴性样品（C）、不含黄芩的阴性样品（D）和不含甘草的阴性样品（E）在240 nm处色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), sample(B), negative sample without Common Gardenia Fruit(C), negative sample without Baikal Skullcap Root(D), and negative sample without Liquorice Root(E)at 240 nm |
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8.绿原酸（chlorogenic acid） 图 2 混合对照品（A）、样品（B）和不含栀子的阴性样品（C）在327 nm处色谱图 Figure 2 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), sample(B), and negative sample without Common Gardenia Fruit(C)at 327 nm |
精密吸取混合对照品溶液1、10、15、20、40、60 μL进样测定；以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标进行线性回归，得京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素、绿原酸的线性回归方程，见表 1。
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表 1 8个成分的线性回归方程 Table 1 Linear regression equations of eight components |
取混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测得混合对照品中京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素、绿原酸峰面积的RSD（n=6）分别为1.1%、0.95%、0.47%、0.28%、1.4%、0.44%、1.2%、1.3%。
2.5 稳定性试验取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、12、24 h进行测定，测得京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素、绿原酸峰面积的RSD（n=6）分别为1.4%、1.6%、0.85%、0.48%、1.5%、1.7%、0.76%、1.2%，表明供试品溶液在常温下24 h内稳定。
2.6 重复性试验取栀芩清热合剂样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，以“2.2”项下色谱条件进行测定，得京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素、绿原酸的平均含量（n=6）分别为1.768 7、1.147 9、10.188 5、11.261 5、2.777 5、1.031、0.973 1、0.178 8 mg·mL-1，RSD分别为1.5%、0.96%、1.3%、0.4%、1.5%、1.2%、1.0%、1.6%。
2.7 加样回收率试验精密称取“2.6”项已测知含量的样品0.6 mL，共9份，平均分为3组，按低、中、高浓度（80%、100%、120%）分别加入一定量的京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素、绿原酸对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试溶液，进样20 μL进行测定，结果见表 2。
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表 2 回收率试验结果（n=9） Table 2 Results of recovery test |
取3批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，外标法计算待测成分含量，结果见表 3。
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表 3 栀芩清热合剂中8个成分的测定（mg·mL-1，n=3） Table 3 Determination of eight components in Zhiqin Qingre mixture |
由于栀芩清热合剂是《中国药典》2015年版中新收录的中成药，测定其成分含量相关资料很少，在流动相的选择上，首先考察了药典中收录的方法[1]，乙腈-水（15: 85）等度洗脱，待测组分不能全部出峰，由于测定的组分较多，等度洗脱较难实现分离，所以笔者接着测试了乙腈-磷酸水、甲醇-磷酸水2个溶剂系统梯度洗脱[6-15]，结果发现甲醇-磷酸水为流动相时，栀子中的几个待测组分京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、绿原酸分离不好，与杂质峰重合。而采用乙腈-磷酸水梯度洗脱时，可以达到分离要求。
3.2 波长的选择波长扫描得到绿原酸最大吸收波长为327 nm，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素为278 nm，甘草酸为250 nm。本实验中，除绿原酸外，其余成分作者选取了240 nm，能兼顾各个组分，色谱图特征性强，各组分的响应值较为均匀，具有良好的代表性。
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