酰胺类杀菌剂是近几年国外公司开发的用于防治卵菌纲病害的药物，主要有双炔酰菌胺、噻唑菌胺、吲唑磺菌胺、硅噻菌胺和吡噻菌胺等。这些新型杀菌剂的特点是作用机理独特，与甲霜灵等杀菌剂无交互抗性，活性高、持效期长、安全性高。尽管新型酰胺类杀菌剂属于低毒类农药，但是随着这些新型酰胺类杀菌剂的登记、推广和使用，该类农药残留问题也逐渐被人们所关注，欧盟、美国等发达国家和地区以及我国标准和法规对该类农药制定了最高残留限量^[1-3]。欧盟规定硅噻菌胺在桔子、苹果、番茄等水果和蔬菜中的最大残留限量为0.01 mg·kg^-1；双炔酰菌胺在桔子、苹果、番茄等水果和蔬菜中的最大残留限量为0.01 mg·kg^-1；吡噻菌胺在桔子、苹果、番茄等水果和蔬菜中的最大残留限量分别为0.01、0.5、0.05 mg·kg^-1；我国最新颁布的食品安全国家标准GB 2763-2016《食品中农药最大残留限量》规定了结球甘蓝、花椰菜等蔬菜中的双炔酰胺菌胺最大残留限量分别为3、2 mg·kg^-1。随着这些法规的实施，我国农产品出口遭遇了新一轮的技术壁垒，为了应对国外的技术壁垒，急需建立同时检测植物源性产品中多种酰胺类杀菌剂的分析方法。

目前国内外公开报道的新型酰胺类杀菌剂分析手段主要有免疫分析法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱联用法^[4-11]。免疫分析法、气相色谱法和液相色谱法存在着特异性低、定性不够准确、灵敏度低等缺点，而液相色谱-质谱联用法具有定性准确，灵敏度高，已经被广泛应用于农药、兽药残留领域的定性、定量等确证检测工作中。目前未查阅到同时检测上述5个酰胺类杀菌剂的文献报道。为满足实际检测工作需要，本文建立液相色谱-串联质谱法同时测定植物源性产品中5个酰胺类杀菌剂的残留量，该方法能满足进出口植物源性产品中5个酰胺类杀菌剂的分析要求。

1 仪器与试药 1.1 仪器

TSQ VANTAGE液相色谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源（赛默飞世尔科技有限公司）；离心机：转速≥8 000 r·min^-1（赛默飞世尔科技有限公司）；高速匀浆机（IKA公司）；MS3 basic漩涡振荡器（IKA公司）；超纯水仪（ELGA公司）；分析天平（梅特勒-托利多公司，万分之一）。

1.2 材料与试剂

乙腈、冰乙酸、甲酸、氯化钠、甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；基质分散固相萃取剂：4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠；基质分散固相净化剂：150 mg无水硫酸镁，25 mg PSA，75 mg GCB；0.22 mm有机滤膜；超纯水（由超纯水仪制得）。标准物质：双炔酰菌胺、噻唑菌胺、吲唑磺菌胺、硅噻菌胺、吡噻菌胺（纯度 > 98.0%，Dr公司）。

2 试验条件与方法 2.1 标准溶液的制备

标准储备液：分别精密称取适量的双炔酰菌胺、噻唑菌胺、吲唑磺菌胺、硅噻菌胺、吡噻菌胺标准物质，用乙腈溶解并定容，配制成1.0 mg·mL^-1的标准储备液。在-18 ℃冰箱保存。

混合标准中间液：分别准确移取适量标准储备液，用甲醇逐级稀释成10.0 μg·mL^-1的混合标准中间液。

基质标准工作液：准确移取混合标准中间液适量，用空白样品基质溶液配制成浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 ng·mL^-1的混合标准工作液，现配现用。

2.2 样品前处理方法

称取试样10 g（精确到0.01 g）置于50 mL离心管中，加入1%乙酸乙腈溶液20 mL，均质提取1 min，加入无水硫酸镁4 g，氯化钠1 g，柠檬酸钠1 g和柠檬酸氢二钠0.5 g，涡旋1 min，于8 000 ·min^-1离心5 min，待净化。

取上述提取液2 mL至基质分散固相净化剂（150 mg无水硫酸镁，25 mg PSA，75 mg GCB）中，涡旋混匀1 min，于8 000 r·min^-1离心5 min。取上清液0.5 mL，加水0.5 mL，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

2.3 液相色谱条件

色谱柱：Accucore XL C₁₈（4.6 mm×150 mm，4.0 μm）；甲醇（A）和0.1%甲酸水溶液（B）为流动相；柱温40 ℃；进样量10 μL；液梯度洗脱（0~1.0 min，45%A；1.0~3.0 min，45%A→80%A；3.0~8.0 min，80%A→95%A；8.0~12.0 min，95%A；12.0~13.0 min，95%A→45%A；13.0~17.0 min，45%A）；流速：0.4 mL·min^-1。

2.4 质谱参数

离子源：电喷雾离子化（ESI）正离子模式；电喷雾电压：3 kV；鞘气压力：137.9 kPa；毛细管温度：275 ℃；干燥气流速：2.67 L·min^-1；干燥气温度：20 ℃；多反应监测（MRM）扫描采集参数见表 1。

3 方法学考察 3.1 标准曲线和定量下限

取“2.1”项下方法制备好的基质标准工作液，以“2.3”和“2.4”项下的条件进行测定，记录目标分析物的峰面积，以各目标分析物的浓度（X）为横坐标，以目标分析物的峰面积（Y）为纵坐标，进行回归分析。5个酰胺类杀菌剂在2.0~60.0 ng·mL^-1范围内呈良好的线性关系。

该方法的检出下限和定量下限由空白样品添加目标分析物进行回收实验获得，按“2.2”项下的条件进行处理，“2.3”和“2.4”项下的条件进行测定，以3倍信噪比（S/N > 3）为检出下限、10倍信噪比（S/N > 10）为定量下限。结果见表 2。

3.2 回收率

选用空白白菜、芹菜、番茄等为样品基质，添加不同量的酰胺类杀菌剂标准溶液，加标水平分别为10.0、20.0、100.0 μg·kg^-1，每个添加水平均做6个平行样，其结果见表 3。

3.3 方法基质效应

取空白白菜基质样品，按“2.2”项下方法制得空白基质溶液，用空白基质溶液将混合标准中间液稀释至2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 ng·mL^-1，制成基质标准工作液。另取混合标准中间液，用甲醇-水（1:1）稀释，制成质量浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 ng·mL^-1的纯溶剂标准工作液。将上述2种工作液分别进样，绘制标准曲线。分别使用2条标准曲线对不同添加浓度的白菜基质加标样品进行校正。回收率数据见表 4，从表 4可以得出，使用纯溶剂标准曲线进行校准，除硅噻菌胺回收率能够达到70%以上外，其他4个酰胺类杀菌剂回收率基本上低于70%；而使用基质标准曲线进行校正，5个酰胺类杀菌剂回收率在71.0%~95.0%。经过前处理后的样品存在着较明显的基质抑制效应，使用基质曲线进行定量能够有效地降低基质效应的影响，定量结果更加准确可靠。因此，本研究使用基质标准曲线进行定量。表 4为纯溶剂标准曲线和白菜基质标准曲线校准后回收率数据。

4 讨论 4.1 液相色谱条件的选择

色谱柱的选择：通过查阅文献资料及对5个酰胺类杀菌剂结构与性质进行分析，5个酰胺类杀菌剂是中等到偏弱极性化合物^[12]，在C₁₈反相色谱柱上有着较强的保留。对不同型号的C₁₈柱（Accucore XL C₁₈，150 mm×4.6 mm，4 μm；Eclipse plus C₁₈，100 mm×2.1 mm，3.5 μm；Hypersil gold C₁₈，50 mm×2.1 mm，1.9 μm）进行了对比，上述3款色谱柱对目标化合物都能很好地保留，且大部分分析物能够达到基线分离，但是Hypersil gold C₁₈柱和Eclipse plus C₁₈柱由于柱长短，无法将分析物与样品基质有效分离，导致分析物受基质抑制较严重，综合考量，最终选择保留时间较长、能够实现分析物与基质分离的Accucore XL C₁₈柱作为分析用色谱柱。

流动相的选择：目标化合物采用MRM正离子扫描模式，有机相常选用乙腈、甲醇溶液，水相通常使用甲酸水、乙酸铵水溶液或两者的混合溶液。通过实验对比，尝试了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液的流动相系统，双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、吡噻菌胺使用上述流动相体系都有很强的响应，其中吲唑磺菌胺由于本身结构特殊，可以在正离子和负离子模式下离子化，在2种离子化模式下响应较其他4种酰胺类杀菌剂低，而使用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相能够提高吲唑磺菌胺的在正源模式下的响应强度。因此，本方法选择甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相。优化后色谱的条件见“2.3”项下液相色谱条件。

4.2 质谱参数的建立

本实验参照国内外的文献报道，采用1 μg·mL^-1待测化合物的标准溶液，分别以流动注射的方式进行母离子全扫描，确定每个农药的母离子质量数。双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、吡噻菌胺在正源模式下进行优化，确定母离子。根据文献报道，吲唑磺菌胺可以在正源和负源模式下离子化，且吲唑磺菌胺其结构式含有1个溴元素，同位素丰度比接近1/1，在同一离子化模式下存在响应一致的同位素峰，分别对其进行正源模式和负源模式优化，优化后发现正源模式下信号较好，正源模式下母离子分别为m/z 466.0、468.0。对2个母离子分别进行子离子优化，根据优化结果，m/z 466.0作为母离子确定的离子对信号较强且相对稳定，因此，选择m/z 466.0作为母离子。确定好母离子后，分别对喷雾电压、蒸发温度、毛细管温度、蒸发气体流速、辅助气流速进行优化，根据文献报道，吲唑磺菌胺易发生源内裂解^[13]，因此，喷雾电压、蒸发温度设置较低。然后分别对5个酰胺类杀菌剂进行子离子及碰撞能量优化，选择2个特征子离子，选择信噪比大、峰形好、干扰小的离子作为定量离子，另一个离子为定性离子，建立MRM模式。5个酰胺类杀菌剂的详细质谱参数如表 2所示。优化后的条件见“2.4”项下质谱参数。图 1为5个酰胺类杀菌剂基质标准溶液在MRM模式下采集到的色谱图（浓度为0.01 μg·mL^-1）。

4.3 提取条件的选择

本研究使用Quechers法进行萃取，Quechers法常用的提取试剂有乙腈、1%乙酸乙腈等^[10-11]。实验比较了乙腈、1%乙酸乙腈的提取效果，发现采用1%乙酸乙腈的提取效果较好，发现采用1%乙酸乙腈作为提取试剂。Querchers萃取包中含有氯化钠和无水硫酸镁，均能促使水相与有机相分离。其中氯化钠利用盐析原理使乙腈相与水相分离，无水硫酸镁以结晶的方式吸水，水相因被吸附而迅速减少。本研究采用4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，然后均质1 min，在无水硫酸镁吸附一部分水相的同时，剩余少量的水利用氯化钠的盐析作用与有机相分离。无水硫酸镁与氯化钠混合后不易板结，既能提高农药组分的萃取率，又不会产生局部过热的现象。确定后的提取条件见“2.2”项。

4.4 净化条件的选择

良好的样品净化能够有效地去除基质干扰组分，可以很好地降低基质效应^[14-16]。Quechers法因其简单、快速等特点而广泛用于农残分析。双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、吡噻菌胺、吲唑磺菌胺的极性相对较弱，通过查找文献，主要的净化方式有Sep-pack Vac复合固相萃取柱、GCB柱、Florisil柱、NH₂柱净化，用ODS C₁₈-N、PSA等进行分散净化。本研究比较了Florisil柱和C₁₈柱，150 mg无水硫酸镁、25 mg PSA、25 mg GCB，150 mg无水硫酸镁、25 mg PSA、75 mg GCB等几种净化方法，发现Florisil、C₁₈固相萃取柱可有效去除基质，但是Florisil对于深色果蔬色素的净化效果较差。C₁₈固相萃取柱对吲唑磺菌胺吸附很强，洗脱剂很难将吲唑磺菌胺完全洗脱下来，导致吲唑磺菌胺回收率偏低。因此，本研究选用净化效果更好的150 mg无水硫酸镁、25 mg PSA、75 mg GCB尺寸样品进行净化。

5 实际样品测定

采用本研究建立的分析方法，对从市场上购买的草莓、葡萄、芹菜、白菜、黄瓜、番茄、梨、生菜等样品进行测定，在葡萄中有检出酰胺类杀菌剂，检出结果均符合欧盟等国家和国内法规要求。

6 结论

本研究建立了液相色谱-串联质谱法测定植物源性产品中5个酰胺类杀菌剂残留量的分析方法，该方法采用1%乙酸乙腈并结合Quechers法（4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠）进行提取，使用150 mg无水硫酸镁、25 mg PSA、75 mg GCB进行净化，该方法具有快速、灵敏度高、定性和定量结果准确等优点，能够满足国内外法规中对该类药物的限量要求。