2018, Vol. 38 
2. 齐鲁制药有限公司, 济南 250100
2. Qilu Pharmaceutical Co., Ltd., Jinan 250100, China
唑类抗真菌药是近年来发展起来的一类合成抗真菌药，于20世纪60年代末问世，克霉唑和咪康唑为这类药物的先驱。唑类抗真菌药研究发展较快，已由早期的咪康唑类抗真菌药物如克霉唑、咪康唑、酮康唑、益康唑、奥昔康唑等，发展到以氟康唑、伊曲康唑、沙派康唑和泊沙康唑等为代表的三氮唑类抗真菌药物[1]。泊沙康唑是伊曲康唑的衍生物，于2006年上市，为第二代高亲脂性三唑类抗真菌药物，是一种新的化学分子实体，也是第一个被FDA批准用于预防侵袭性曲霉菌所引起病变的抗菌药物。与其他唑类抗菌药物相同，泊沙康唑也是通过与羊毛甾醇14α-去甲基酶（CYP51或Erg11p）活性部位的血红素辅助因子结合，抑制真菌麦角甾醇的生物合成，破坏真菌细胞膜的形成和完整性，从而起到抗菌作用[2-3]。其抗真菌的作用无论是在体内和体外都已经被证实具有广谱的活性，对念珠菌、各种曲霉菌及其他常见的和非常见的致病真菌均有较大活性[3]。参考姚华等[4]的研究结果，伊曲康唑类药物对真菌的抗菌作用强于对细菌的抗菌作用，可能是因为羊毛甾醇14α-去甲基化酶是普遍存在于高等植物、真菌和哺乳动物体内甚至非洲昏睡症病原体锥虫细胞膜上的P450蛋白[5-6]。鉴于泊沙康唑强烈的抗真菌作用，无菌检查时如何有效地去除其抗真菌活性十分关键。滤膜的成分、结构和性能决定了其应用范围，本文通过测定硝酸纤维膜、尼龙膜、混合纤维素膜和PVDF膜过滤后膜上的样品残留量，考察不同材质滤膜对泊沙康唑的吸附性差异。刘想虎等[7]制备的伊曲康唑-羟丙基-β-环糊精包合物颗粒提高了伊曲康唑的水溶性，张志清等[8]制备氟康唑的β-环糊精剂型包合物，改善了药物的稳定性。参考这些文献，对泊沙康唑无菌检查样品前处理方法和冲洗条件进行了优化。鉴于目前国内尚无泊沙康唑无菌检查方法的文献报道，本文描述的无菌检查方法对其他三唑类产品的无菌检查问题有较好的参考作用。
1 仪器与试药 1.1 仪器HPLC（Waters 2695）；高压真空脉动灭菌柜（新华医疗机械设备股份有限公司XG1.GTE-0.6B）；集菌仪（密理博EQUINOH4）；生物安全柜（ESCO AirstreamB2）；细菌培养箱（上海一恒GHP-9270）；真菌培养箱（上海一恒LRH-250）；真空过滤系统排液泵（赛多利斯）；酸度计（梅特勒FE-20）；天平（赛多利斯BSA4202S-CW，精度：0.001 g）。
1.2 试验菌种枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC（B）63501]；大肠埃希菌[Escherchia coli CMCC（B）44102]；金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus CMCC（B）26003]；生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]；白色念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001]；黑曲霉[Aspergillus niger CMCC98003]。以上菌株均来自中国食品药品检定研究院医学微生物菌种保藏中心。
1.3 培养基硫乙醇酸盐流体培养基（OXOID）；胰酪大豆胨液体培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）；胰酪大豆胨琼脂培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）。
1.4 试剂乙二胺四乙酸（EDTA）（天津广成化学试剂有限公司，分析纯）；聚山梨酯80（国药集团化学试剂有限公司，化学纯）；氯化钠（天津广成化学试剂有限公司，分析纯）；泊沙康唑注射液（批号1402001、1402002、1402003，规格16.7 mL·支-1，齐鲁制药有限公司）；四氢呋喃（天津康科德科技有限公司，色谱纯）；磷酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；乙腈（Merck，色谱纯）；0.9%氯化钠注射液（山东华信制药集团股份有限公司，注射级）；泊沙康唑对照品（批号131220S，含量99.7%，齐鲁制药有限公司）。
1.5 滤膜硝酸纤维膜（赛多利斯）；尼龙膜（北京牛牛基因有限公司）；混合纤维素膜（密理博）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜及集菌培养器（密理博）。
2 方法与结果 2.1 滤膜的选择所有滤膜对静注药物均存在不同程度的吸附作用，其大小与药物种类和性质相关，而药物的吸附作用由滤膜材质决定，滤膜的表面结构和滤器的构造不同，对药物的吸附量也有较大差异，应尽量选择吸附作用小的惰性材料作为滤膜[9]。选择硝酸纤维、尼龙、混合纤维素和PVDF 4种常见材质的滤膜进行比对实验，采用高效液相色谱法测试滤膜过滤样品后残留的泊沙康唑，比较不同滤膜对泊沙康唑的吸附性差异。
2.1.1 测试色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm×75 mm，3.5 μm）；流动相：水-四氢呋喃-磷酸（684:316:1.5）；稀释剂：水-乙腈-磷酸（75:25:1）；流速：1.5 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。
2.1.2 溶液液制备沙康唑对照品溶液：取泊沙康唑对照品约25 mg，精密称定，转移至25 mL量瓶中，加稀释剂超声溶解，摇匀，精密移取1 mL至100 mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
HPLC检测供试液：取泊沙康唑注射液样品10、40、167 mL，分别用尼龙膜、PVDF膜、硝酸纤维素膜、混合纤维素膜过滤，用流动相将滤膜上的泊沙康唑样品残留超声洗脱10 min，同时不断振摇，使滤膜充分浸润，然后将溶液转移至10 mL量瓶中，摇匀，定容，取上层溶液作为供试液。
2.1.3 泊沙康唑滤膜吸附试验在“2.1.1”色谱条件下，取空白溶液注入色谱仪，确定空白溶剂无干扰。取对照溶液和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算滤膜上泊沙康唑的残留量。各种滤膜对泊沙康唑吸附测试结果见表 1，泊沙康唑对照品色谱图见图 1。结果显示，不同材质的滤膜对泊沙康唑的吸附程度不一致，其中以PVDF材质的滤膜吸附最小，因此选用PVDF材质的薄膜过滤器。
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表 1 4种不同滤膜对泊沙康唑吸附试验测试结果 Table 1 Test results of four different filter membranes on the adsorption of pothiazol |
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1.泊沙康唑（pothiazol） 图 1 HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatogram |
参考《中华人民共和国药典》2015年版四部通则[10]，接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌至胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中，接种生孢梭菌至硫乙醇酸盐流体培养基（FTM）中，30~35 ℃培养24 h；接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖肉汤培养基中，20~25 ℃培养48 h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL中含菌数小于100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉至马铃薯萄糖琼脂培养基斜面，20~25 ℃培养5~7 d，直至生孢明显，用无菌0.05%聚山梨酯80-氯化钠溶液制成每1 mL中含孢子小于100 cfu的孢子悬液。
2.2.2 无菌检查用稀释液pH的筛选由于泊沙康唑注射液呈酸性，pH若不在2.0~4.0之间，将降低样品的稳定性，导致样品析出，因此，需要确定无菌检查用稀释液pH范围。分别取40 mL样品注入pH 3.0~8.0的400 mL 0.9%氯化钠稀释液中，对比样品在不同pH稀释液中的稳定性。实验结果显示，稀释液在pH 3.62~3.89能够较好地保持样品稳定性，不会产生析出（表 2）。同时各试验菌在稀释液中作用5 min与10 min对微生物的生长影响不大，且pH在3.45~3.80之间，微生物生长情况一样。低于该范围，金黄色葡萄球菌和生孢梭菌生长受到影响；高于该范围，样品将析出。因此，确定稀释液的pH为3.80。
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表 2 不同pH稀释液中样品的稳定性比较 Table 2 Comparison of the stability of samples solution in different pH diluents |
《中华人民共和国药典》2015年版规定：注射剂出厂产品批产量 > 500最少检验数量是20个；而液体制剂规格（V）1 mL < V≤40 mL，每支供试品可半量接入每种培养基。阳性对照实验和验证实验仅需满足“检验量”总量要求即可，以检验样品对实验结果的影响[11]，而本产品规格为每支16.7 mL，所以每种培养基以167 mL样品为最大验证样品量。分别取样品40、167 mL，加入pH 3.8的0.9%氯化钠溶液（含0.1%聚山梨酯80）稀释至500 mL，供试液全部过滤1个滤筒后，分别用pH 3.8的0.9%氯化钠溶液（含0.1%聚山梨酯80）400 mL与900 mL 2个条件冲洗，最后一遍用100 mL的0.9%氯化钠冲洗并加入约含活菌数 < 100 CFU·mL-1的各试验菌1 mL，将100 mL的FTM、TSB分别加入各滤筒，对比试验菌的生长情况。样品检验量及冲洗体积确定实验结果见表 3。不同样品检验量情况下，采用pH 3.8稀释液与不同冲洗量（500 mL每膜和1 000 mL每膜），各试验菌均可生长，但是样品检验量的增大影响了部分菌的生长时间。
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表 3 不同样品量及冲洗量对试验菌生长的影响 Table 3 Effects of different sample quantity and flushing volume on the growth of experimental microbial |
由于样品中EDTA对试验菌生长存在影响，取167 mL样品加入pH 3.8的0.9%氯化钠溶液（含0.1%聚山梨酯80）稀释至500 mL，供试液全部滤过一个滤筒后，分别用pH 3.8的0.9%氯化钠溶液（含0.1%吐温80）冲洗4次，每次100 mL，最后一遍以100 mL 0.9%氯化钠冲洗并加入约含活菌数 < 100 cfu·mL-1的各试验细菌1 mL。在一组培养基中添加1 mg·mL-1氯化钙，另一组培养基不添加，比较试验菌的生长情况。结果发现，在FTM及TSB培养基中添加钙离子，细菌管缩短至24 h生长良好，这是因为通过钙离子与EDTA发生螯合反应，降低了EDTA的抑菌活性。
3 结论通过本文的研究，取20支泊沙康唑注射液（规格：16.7 mL·支-1），以pH 3.8的无菌0.9%氯化钠溶液（含0.1%聚山梨酯80）稀释液至1 000 mL，通过1组PVDF材质滤膜的双联滤器，滤过，分别以pH 3.8的无菌0.9%氯化钠溶液（含0.1%聚山梨酯80）冲洗滤膜，每膜每次100 mL，冲洗4次后，再以每膜100 mL无菌0.9%氯化钠溶液冲洗1次，分别接入100 mL含1 mg·mL-1氯化钙的TSB以及FTM，以白色念珠菌为阳性对照菌，可以进行符合《中华人民共和国药典》2015年版要求的无菌检查。
4 讨论 4.1 高活性产品建立无菌检查法的策略由于泊沙康唑注射液具有较强的抗真菌活性，为建立快速有效的无菌检查方法，按抗菌药物无菌检查法的一般流程[11]，对滤膜的材质、稀释液的组分、pH、样品量大小、冲洗条件等试验条件进行了优化，并以药典规定[10]的6种无菌检查试验菌株是否能正常生长为指标，最终建立了适合泊沙康唑注射液无菌检查的方法，对其他三唑类产品的无菌检查起到较好的参考作用。
4.2 关于滤膜的选择不同的滤膜材质、制造方法、结构和性能，决定了滤材的应用范围：尼龙膜能耐受大多数有机溶剂和多数碱性溶液，特别适合于碱性溶液的过滤，但是吸附性强[12]；纤维素滤膜虽然水渗透流率高，截留率好，但易吸附有机物上的羟基；混合纤维素滤膜虽然空隙率高、速度快，但是具有较强吸附作用[13]；PVDF的特点是耐酸碱，具有较强的疏水性。实验分别取不同体积的样品通过4种常用滤膜，采用高效液相色谱仪测试滤膜上残留的样品，发现虽然样品量不同，但3组实验结果均是尼龙膜、硝酸纤维素膜和混合纤维素膜对泊沙康唑的吸附性大于PVDF膜，为无菌检查时选择PVDF膜作为实验滤膜提供了实验依据。
4.3 pH、聚山梨酯80和钙离子对检验结果的影响聚山梨酯80属多元醇型非离子表面活性剂，是《中华人民共和国药典》2015年版通则1105[10]中收载的表面活性剂，有助于冲洗滤筒壁及滤膜上的样品残留，起到降低抑菌活性的作用。由于样品中含有能抑制试验菌生长的EDTA，所以，在培养基中添加钙离子以中和EDTA活性。泊沙康唑注射液的pH范围在2.5~3.8之间，实验证明，如果pH过高，样品容易从稀释液中析出，无法从滤膜通过，从而也无法消除其抑菌性，所以通过稀释剂的对照实验，选择pH 3.8的稀释液和冲洗液。
4.4 供试品浓度与冲洗体积对检验结果的影响不同体积的供试液和冲洗液对实验结果存在影响，分别取40 mL和167 mL样品量加入500 mL稀释液中，结合表 4的测试结果可以看出，一定条件下冲洗体积与样品浓度而不是绝对量更密切相关。相同冲洗体积下，随着样品量增多，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌生长有明显的差别，而加大冲洗体积虽然能够去除这种差别，但过大的冲洗量可能降低检出率，所以综合考虑，以在培养基中增加钙离子的辅助方式，确定167 mL样品量稀释至500 mL并以每膜500 mL的冲洗方式，保证检查效果。
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