2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
2. 山东省分析测试中心, 济南 250001;
3. 山东省医学科学院药物安全评价中心, 济南 250012
2. Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250001, China;
3. Drug Safety Evaluation Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250012, China
雷贝拉唑钠（rabeprazole sodium）为苯并咪唑类质子泵抑制剂，可特异性地抑制胃壁细胞H+/K+-ATP酶抑制胃酸分泌，临床用于治疗消化性溃疡、胃食管反流性疾病、卓-艾氏综合征等[1]。雷贝拉唑钠结构中含有手性中心，研究表明，与左旋体及消旋体比较，雷贝拉唑钠右旋体具有更强的溃疡抑制作用[2-3]。2007年，右旋雷贝拉唑钠肠溶微丸胶囊（商品名：DexPure；规格：10 mg）已由印度EMCURE制药公司开发上市。目前，国内已进行口服右旋雷贝拉唑钠肠溶片的研发，本文报道了Beagle犬口服雷贝拉唑钠右旋体的药代动力学性质，为其进一步开发提供参考。
1 仪器与材料AB SCIEX 5500三重串联四极杆质谱系统，美国赛默飞世尔科技公司生产。Vortex-5型涡旋振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产。Heraeus Multifuge X1R型高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司。AL104型天平，0.01 mg，梅特勒-托利多仪器上海有限公司生产。
左旋雷贝拉唑钠（批号20121013，纯度99.08%）、右旋雷贝拉唑钠（批号20121017，纯度99.23%）、硫醚雷贝拉唑（批号20121102，纯度99.36%），去甲基雷贝拉唑（批号20121117，纯度98.29%）、雷贝拉唑砜（批号20121027，纯度99.36%），由山东省药学科学院自制；右旋雷贝拉唑钠肠溶片（规格10 mg，批号20120926），由山东省药学科学院自制。非那西丁（批号100095-201205），由中国食品药品检定研究院提供。色谱纯甲醇、乙腈，由瑞典OceanPak公司生产。色谱纯甲酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
Beagle犬8只，雌雄各半，由广州医药工业研究院实验动物研究开发中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2008-0007。Beagle犬于普通级环境饲养，每笼1只，室温19~26 ℃，湿度40%~70%，日温差≤4 ℃，换气次数8~10次·h-1，昼夜明暗交替时间12 h/12 h，实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）20100004。
2 方法 2.1 色谱与质谱条件色谱条件：AGP 30713色谱柱（40 mm×100 mm，5 μm），柱前安装与AGP色谱柱配套的预柱（40 mm×100 mm，5 μm），大赛璐药物手型技术（上海）有限公司；初始流动相：甲醇-水（5:95）；梯度洗脱：0~3 min 5%→12%甲醇，3~5.5 min 12%→15%甲醇，5.6~15 min 15%→5%甲醇；样品检测时间15 min；流速：0.5 mL·min-1；进样量：5.0 μL。
质谱条件：AB SCIEX 5 500三重串联四极杆质谱系统，电喷雾离子源，正离子检测，干燥气N2，毛细管温度350℃，雾化器温度300 ℃，辅助气流速30 arb，鞘气压力60 arb，电压3 500 V，多重反应监测模式（MRM）；检测离子对为m/z 360.1/150.1、m/z 360.1/195.2（雷贝拉唑），m/z 344.1/154.1、m/z344.1/226.1（硫醚雷贝拉唑），m/z 346.1/150.1、m/z 346.1/228.2（去甲基雷贝拉唑），m/z 376.2/119.1、m/z376.2/158.2（雷贝拉唑钠砜），m/z 180.0/110.1、m/z 180.0/138.1（非那西丁）。
2.2 混合对照品储备液及内标溶液制备精密称取对照品右旋雷贝拉唑钠、左旋雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑、去甲基雷贝拉唑、雷贝拉唑砜适量，分别用甲醇配成1 mg·mL-1的储备液。精密量取各储备液适量，用甲醇稀释为含雷贝拉唑钠左旋体、右旋体及3个代谢产物浓度均为10.00 μg·mL-1的混合对照品储备液。
精密称取非那西丁适量，用甲醇配成浓度为200 ng·mL-1的内标溶液。
2.3 样品处理方法取Beagle犬血浆样品100 μL置于1.5 mL离心管中，加入非那西丁（200 ng·mL-1）内标溶液50 μL，再加入乙酸乙酯500 μL，充分混匀震荡3.0 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液450 μL置于新的1.5 mL离心管中，氮吹吹干，加入初始流动相甲醇-水（5:95）200 μL复溶，取5 μL进样检测。
2.4 Beagle犬药代动力学试验取Beagle犬8只，禁食12 h后，每只口服给予右旋雷贝拉唑钠肠溶片10 mg，分别在给药前及给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6 h自犬后肢静脉取血约2 mL，置于含肝素的离心管中，0 ℃，3 500 r·min-1，离心10 min，取上层血浆置-80 ℃冰箱保存待测。
2.5 数据处理根据右旋雷贝拉唑钠及其代谢物去甲基雷贝拉唑、雷贝拉唑砜和硫醚雷贝拉唑血药浓度-时间数据，利用DAS2.1软件，以非房室模型分别计算t1/2、Tmax、Vd、CL、Cmax、AUC（0-6 h）、AUC（0-∞）等药代动力学参数。
3 结果 3.1 专属性分别取6只犬空白血浆100 μL，按“2.3”项下方法操作，分别经LC-MS/MS分析，得空白血浆色谱图，如图 1-A所示；取适量雷贝拉唑钠左旋体、右旋体及硫醚雷贝拉唑、去甲基雷贝拉唑和雷贝拉唑砜的混合对照品溶液，加入到空白血浆中，按“2.3”项下方法操作，经分析所得色谱图，如图 1-B所示；给药后血浆样品加内标的代表性色谱图见图 1-C；待测物左旋雷贝拉唑钠、右旋雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑、去甲基雷贝拉唑、雷贝拉唑砜和内标非那西丁的色谱保留时间分别为7.59、5.12、11.36、5.92、9.49、3.92 min。血浆中内源性物质不干扰左、右旋雷贝拉唑钠及其3个代谢产物的测定。
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1.内标非那西丁（internal standard，phenacetin）2.右旋雷贝拉唑钠[（R）-rabeprazole sodium] 3.去甲基雷贝拉唑钠（desmethyl rabeprazole）4.左旋雷贝拉唑钠[（S）-rabeprazole sodium] 5.雷贝拉唑砜（rabeprazole sulfone）6.硫醚雷贝拉唑钠（rabeprazole thioether）A.空白血浆（blank plasma sample）B.空白血浆中加入右旋雷贝拉唑钠、左旋雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑、去甲基雷贝拉唑、雷贝拉唑砜加内标（blank plasma sample spiked with（R）-rabeprazole sodium，（S）-rabeprazole sodium，rabeprazole thioether，rabeprazole sulfone，and desmethyl rabeprazole）C.给药1 h后血浆样品加内标（a plasma sample spiked with internal standard at 1 h after oral administration） 图 1 LC-MS/MS色谱图 Figure 1 Chromatograms of LC-MS/MS |
取空白血浆100 μL，加入含左、右旋雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑、去甲基雷贝拉唑，雷贝拉唑砜混合对照品储备液，配制质量浓度为2、4、10、20、80、200、800、2 000 ng·mL-1的标准血浆样品，每一浓度6份，从加入内标溶液起按“2.3”项下方法操作。以待测物的浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法（权重为1/X2）进行回归运算，求得直线回归方程。左、右旋雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑、去甲基雷贝拉唑，雷贝拉唑砜的回归方程：
| $ \begin{align} &Y=1.264\times {{10}^{-2}}X-6.236\times {{10}^{-3}}\ \ \ \ \ r=0.9984 \\ &Y=9.427\times {{10}^{-3}}X-8.625\times {{10}^{-3}}\ \ \ \ \ r=0.9974 \\ &Y=3.128\times {{10}^{-2}}X-0.1980\ \ \ \ \ r=0.9945 \\ &Y=3.973\times {{10}^{-3}}X-4.674\times {{10}^{-3}}\ \ \ \ \ r=0.9965 \\ &Y=3.173\times {{10}^{-3}}X-4.330\times {{10}^{-3}}\ \ \ \ \ r=0.9978 \\ \end{align} $ |
线性范围为2.0~2 000 ng·mL-1，定量下限为2.0 ng·mL-1。
3.3 精密度和准确度按“3.2”项下的方法配制低（4 ng·mL-1）、中（80 ng·mL-1）、高（800 ng·mL-1）3个浓度的标准血浆样品，按“2.3”项下依法操作，每一浓度6个平行样品，连续进行3个批次的样本分析。样品精密度及准确度结果见表 1，各浓度水平雷贝拉唑钠对映体及其代谢物准确度介于90.5%~113.0%之间，批内精密度（RSD）介于1.3%~9.7%之间，批间精密度（RSD）介于1.4%~9.0%之间，符合生物样品分析方法验证的相关要求。
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表 1 精密度与准确度结果（n=6） Table 1 Precision and accuracy of the method |
将空白血浆样品按照“3.2”项下方法提取得到基质溶液，利用基质溶液配制低（4 ng·mL-1）、中（80 ng·mL-1）、高（800 ng·mL-1）3个质量浓度标准血浆样品，并加入非那西丁对照品溶液（终浓度50 ng·mL-1），以检测得到的峰面积为参比，计算5种待测物的相对提取回收率。各浓度水平的雷贝拉唑钠对映体及其代谢物的提取回收率均介于85.9%~113.6%之间，RSD介于1.5%~9.4%之间（表 2），符合生物样品分析方法验证的相关要求。
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表 2 回收率结果（n=6） Table 2 Recovery of the method |
稳定性考察了标准血浆样品室温放置4 h、3次冷冻-解冻循环、-80 ℃冰箱放置7 d的稳定性及处理后标准血浆样品进样器放置24 h的稳定性。结果显示（表 3），血浆样品中各待测物的准确度介于85.7%~113.4%之间，精密度介于1.3%~9.8%之间，表明右旋雷贝拉唑钠血浆样品在以上各条件下稳定。
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表 3 稳定性结果（n=6） Table 3 Stability of the method |
Beagle犬给予右旋雷贝拉唑钠肠溶片10 mg后，所测得雷贝拉唑钠右旋体及其代谢产物的平均血药浓度-时间曲线见图 2，以非房室模型计算所得的药代动力学参数见表 4。Beagle犬口服给予右旋雷贝拉唑钠肠溶片后，血浆中未检测到左旋雷贝拉唑钠，右旋雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠、雷贝拉唑砜及去甲基雷贝拉唑钠的AUC（0-∞）分别为（1 486.82±956.68）、（265.03±182.16）、（79.60±45.92）、（220.10±119.90）μg·h·L-1，t1/2分别为（0.35±0.12）、（1.34±1.07）、（0.43±0.07）、（0.43±0.20）h，Tmax分别为（1.33±0.42）、（1.50±0.35）、（1.42±0.43）、（1.42±0.50）h。
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A.右旋雷贝拉唑钠（R-rabeprazole sodium）B.去甲基雷贝拉唑（desmethyl rabeprazole）C.硫醚雷贝拉唑（rabeprazole thioether）D.雷贝拉唑砜（rabeprazole sulfone） 图 2 Beagle犬口服右旋雷贝拉唑钠肠溶片后右旋雷贝拉唑钠及其代谢物药时曲线（10 mg·只-1，n=8） Figure 2 Plasma concentration-time curves of(R)-rabeprazole sodium and the metabolites after an oral administration of(R)-rabeprazole sodium to Beagle dogs (10 mg·dog-1) |
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表 4 Beagle犬口服右旋雷贝拉唑钠肠溶片后右旋雷贝拉唑钠及其代谢物的药动学参数（10 mg·只-1，n=8） Table 4 Plasma pharmacokinetic parameters of rabeprazole sodium enantiomers and the metabolites after oral administration of(R)-rabeprazole sodium in Beagle dogs (10 mg·dog-1) |
本研究建立了同时测定雷贝拉唑钠对映体及其代谢产物雷贝拉唑砜、硫醚雷贝拉唑及去甲基雷贝拉唑的LC-MS/MS定量分析方法。结果表明，采用手性柱分离对映体，质谱检测其含量的方法，定量准确，精密度高，稳定性好，符合化学药物临床前药代动力学研究的技术要求[4]，可用于雷贝拉唑钠药代动力学研究。
本论文报道了右旋雷贝拉唑钠肠溶片Beagle犬口服后的药代动力学特征，研究选择AGP 30713手性色谱柱，甲醇-水为流动相，梯度洗脱的方法，对雷贝拉唑钠对映体与其3个代谢产物进行了成功分离，分析时间为15 min，与文献报道的雷贝拉唑钠血药浓度的测定方法比较[5-9]，该法不仅对对映体及3种代谢产物进行了同时测定，且缩短了分析时间，更为简单快捷。
在本项研究中，Beagle犬口服雷贝拉唑钠肠溶片10 mg，右旋雷贝拉唑钠的Tmax均值为1.333 h，AUC（0-∞）为1 486.82 μg·h·L-1，t1/2均值为0.35 h，Cmax为1 632.63 ng·mL-1；文献报道，人体口服雷贝拉唑钠肠溶片20 mg，Tmax为药后3~4 h，AUC（0-∞）均值为809 μg·h·L-1，Cmax均值为406 ng·mL-1，t1/2均值为1.02 h[10-13]。比较人与犬药动学参数发现，雷贝拉唑钠在犬体内代谢较快。右旋雷贝拉唑钠的代谢产物以硫醚雷贝拉唑为主，其次为去甲基雷贝拉唑钠和雷贝拉唑砜，这与文献报道的雷贝拉唑钠人体内代谢类型[14-15]一致。
本研究显示，右旋雷贝拉唑钠肠溶片Beagle犬单次口服给药后在体内代谢迅速，未发现右旋体向左旋体的转换，与文献报道结果一致，为右旋雷贝拉唑钠肠溶片的开发提供了参考。
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