2018, Vol. 38 
2. 中国农业科学院特产研究所, 长春 130112
2. Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China
桔梗是桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根，其味苦、辛，性平，归肺经，具有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效[1]。研究表明，桔梗中主要含有皂苷、酚类、黄酮、聚糖和聚炔等多种化学成分，具有抑制皮肤炎症[2]、抑制脂肪生成[3]、抑制乳腺癌[4]、抗肾损伤[5]、抗氧化[6]、抗肺损伤[7]等作用。聚炔类成分是一种较为特殊的天然化合物，主要分布在菊科、桔梗科、五加科、伞形科和海桐花科等植物组织中，党参炔苷作为一种重要的聚炔类化合物已在桔梗中分离得到[8-9]，具有抗胃粘膜损伤[10]、促进雌二醇分泌[11]、抗氧化[12]等药理作用，《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）中把党参炔苷作为党参的一种控制指标，但未将其运用到桔梗的质量控制中去。
加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction，ASE）是使用常见溶剂在加温加压下提取样品，可以大大提高萃取效率，减少溶剂的消耗。与索氏提取、超声提取和微波提取相比，ASE所用的时间更短，能用更低的溶剂量来完成提取并且具有操作模式简单、自动化程度较高及重复性好等优点。本实验优化了加速溶剂萃取法提取桔梗中聚炔类化合物的工艺，并与报道过的提取方法对比，选出了桔梗中聚炔类化合物的最佳提取方法。
本课题组从桔梗中分离纯化出了3种聚炔类化合物，包括党参炔苷和2个新化合物，分别命名为桔梗炔苷A、桔梗炔苷B。本文报道了HPLC同时测定桔梗炔苷A、桔梗炔苷B 2种新聚炔类化合物和党参炔苷的含量，并对不同产地的桔梗药材进行分析，以期为桔梗药材的质量控制及应用提供新的参考。
1 仪器及材料 1.1 仪器高效液相色谱仪（日本岛津），包括LC-16泵、SPD-M20A检测器；伊利特Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；EX125DZH十万分之一电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；DJ1002C高精度电子天平（昆山金珂华电子有限公司）；ASE350加速溶剂萃取仪（美国DIONEX公司，配备有22 mL不锈钢萃取池）；JP-100ST超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；Wp-UP-WF-40沃特浦实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）。
1.2 材料无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇均为分析纯（北京化工厂）；乙腈为色谱纯（Fisher公司）；超纯水、蒸馏水为自制。
桔梗，经吉林农业大学中药材学院郑毅男教授鉴定确认为桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A. DC.的干燥根，药材编号及产地见表 1。党参炔苷对照品，购于上海源叶生物科技有限公司，批号136085-37-5，含量≥98%；桔梗炔苷A、桔梗炔苷B均为自行分离精制，并经UV、HR-TOF-MS、1D-NMR、2D-NMR鉴定结构（见图 1），HPLC检测，面积归一化法计算质量分数均大于98%。
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表 1 样品信息 Table 1 Samples information |
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图 1 3种聚炔类化合物的化学结构式 Figure 1 Structures of three polyacetylenes |
采用伊利特Hypersil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈（B）-水（A），梯度洗脱（0~5 min，5% B；5~15 min，5%B→20%B；15~30 min，20%B→30%B；30~35 min，30%B→100%B；35~40 min，100%B），流速为1 mL·min-1，检测波长210 nm，进样量20 μL。在此条件下，对照品及样品的色谱图见图 2。
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1.桔梗炔苷A（platetyolin A）2.桔梗炔苷B（platetyolin B）3.党参炔苷（lobetyolin） 图 2 混合对照品溶液（A）和样品（B）色谱图 Figure 2 HPLC chromatograms of mixtures reference substances(A) and sample(B) |
精密称取桔梗炔苷A 1.1 mg、桔梗炔苷B 1.6 mg及党参炔苷5.2 mg，分别置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容到刻度，摇匀，即得质量浓度分别为110、160、520 μg·mL-1的溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液取桔梗样品粉碎，过40目筛，精密称取7.0 g，加入3.0 g球状硅藻土混匀，置22 mL不锈钢萃取池中，以甲醇为溶剂，进行加速溶剂萃取，萃取温度为100 ℃，压力为1.17×107 Pa，萃取时间为10 min，萃取1个循环，提取液转移至50 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，取1 mL过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液，待测。
2.3 线性关系考察精密量取3种对照品储备液各0.1、0.25、0.5、1、2、2.5 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。按照“2.1”项色谱条件下分别进样20 μL，记录色谱图。分别以对照品溶液质量浓度为横坐标（X，μg·mL-1），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，绘制标准曲线。得到桔梗炔苷A、桔梗炔苷B和党参炔苷的回归方程分别为：
| $ \begin{align} &Y=8.234\times {{10}^{4}}X-2.815\times {{10}^{4}}\ \ \ \ \ \ {{r}^{2}}=0.9990 \\ &Y=7.902\times {{10}^{4}}X-1.637\times {{10}^{4}}\ \ \ \ \ \ {{r}^{2}}=0.9998 \\ &Y=7.183\times {{10}^{4}}X+7.7370\times {{10}^{5}}\ \ \ \ \ \ {{r}^{2}}=0.9999 \\ \end{align} $ |
结果表明桔梗炔苷A进样量在0.022~0.55 μg、桔梗炔苷B在0.032~0.80 μg、党参炔苷在0.104~2.6 μg内呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验取混合对照品溶液，连续进样6次，记录桔梗炔苷A、桔梗炔苷B、党参炔苷的峰面积积分值，计算RSD分别为0.92%、0.86%、0.68%，表明仪器精密度良好。
2.5 重复性试验取1号桔梗样品粉末6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μL，测定峰面积。计算桔梗炔苷A、桔梗炔苷B、党参炔苷平均质量分数（4.3、14.8、128.9 μg·g-1）的RSD分别为1.5%、1.3%和1.0%，结果表明方法的重复性良好。
2.6 稳定性试验精密吸取1号样品的供试品溶液，分别于制备后的0、2、4、8、16、24 h进样20 μL测定，记录桔梗炔苷A、桔梗炔苷B、党参炔苷的峰面积积分值，计算RSD分别为1.8%、1.1%、0.93%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 加样回收率试验精密称取6份已经测质量分数的1号桔梗样品粉末3.5 g，分别加入对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样，测定并计算桔梗炔苷A、桔梗炔苷B、党参炔苷质量分数的加样回收率，结果见表 2。
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表 2 加样回收率试验结果 Table 2 Recoveries for polyacetylenes in Platycodonis Radix |
按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进行测定，分析和计算样品中桔梗炔苷A、桔梗炔苷B、党参炔苷的质量分数。不同产地的桔梗中3种聚炔类成分含量差异较大，结果见表 3。
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表 3 15批样品中3种聚炔类化合物测定结果 Table 3 Content of three polyacetylenes in 15 batches of samples |
对3种聚炔类化合物甲醇溶液进行全波长扫描，桔梗炔苷A、桔梗炔苷B、党参炔苷的最大吸收波长分别是211 nm；209、255、268、284 nm；206、256、269、284 nm。结果在210 nm处测定可兼顾3个成分最大吸收，且色谱图基线平稳，色谱峰峰形较好，故确定210 nm作为本实验的检测波长。
3.2 提取工艺优化陈璐等、刘同举等、冯月等和冯彬彬等报道了党参炔苷的最佳提取方法为渗漉法[13]、超临界萃取法[14]和超声法[15-16]，但他们的方法时间较长。本实验采用了加速溶剂萃取法，并分别考察了溶剂（水、乙酸乙酯、乙醇、甲醇）、甲醇水比例（100:0、80:20、60:40、40:60、20:80）、提取时间（5、10、15、20和25 min）、提取温度（60、80、100、120和140 ℃）、提取次数（1、2、3次）、桔梗硅藻土比例（g/g）（13:0、11:1、9:2、7:3、5:4），这6个因素对3种聚炔类化合物提取率的影响，发现其他条件相同情况下提取次数对提取率影响不显著，只需要1次提取就可以很充分地提取3种聚炔类化合物，其他5个因素对提取率影响显著，最佳提取条件分别为提取溶剂甲醇，甲醇-水比例100:0，提取时间10 min，提取温度100 ℃，桔梗硅藻土比例（g/g）7:3。然后用优化后的提取工艺和之前文献报道的渗漉法、超声法、超临界萃取法的最佳提取工艺分别对适量的1号桔梗样品粉末进行提取，以计算得到的3种聚炔类化合物质量分数之和为指标比较这4种提取方法提取效果，结果发现加速溶剂萃取 > 超临界萃取 > 超声波提取 > 渗漉法，证明加速溶剂萃取法提取效果最好，而且用时比其他方法都少，仅为10 min，所以选择使用加速溶剂萃取法。
3.3 结果分析由测定结果可以看出，不同产地的3种聚炔类化合物含量差异很大，其中山东潍坊的3种聚炔类化合物总含量最高，为470.3 μg·g-1；此外四川马尔康、朝鲜、四川达州、陕西商洛、吉林延边（未熏硫）、湖北十堰、内蒙古赤峰、广东广州的3种聚炔类化合物总含量依次减少，但其量均大于200.0 μg·g-1。而河南南阳、安徽阜阳、辽宁抚顺、浙江金华、山东泰安、吉林延边（熏硫）的桔梗药材中3种聚炔类化合物总含量较少，其中吉林延边（熏硫）的桔梗药材含量最少，仅为26.6 μg·g-1。通过测定不同产地桔梗药材中的2种新的聚炔类化合物桔梗炔苷A和桔梗炔苷B的含量，发现山东潍坊、湖北十堰、朝鲜的桔梗中含桔梗炔苷A比较多，吉林延边（熏硫）的桔梗中桔梗炔苷A最少，仅为0.3 μg·g-1；湖北十堰、山东潍坊、吉林延边未熏硫、辽宁抚顺的桔梗中桔梗炔苷B含量较多，吉林延边（熏硫）的桔梗中桔梗炔苷B最少，仅为16 μg·g-1；桔梗炔苷A和桔梗炔苷B含量最多与最少产地分别差了144倍和51倍。测定结果发现吉林延边（熏硫）的桔梗中3种聚炔类化合物的含量都是最少，说明熏硫处理可能会使桔梗中3种聚炔类化合物含量下降，影响桔梗的品质，这个发现与之前文献中报道的熏硫使党参中的党参炔苷的含量下降相符合[17-18]。
党参炔苷广泛存在于桔梗、党参等桔梗科植物当中，被认为是桔梗科植物在化学成分上的标志性成分，本课题组从桔梗中分离出了2种新的聚炔类成分，鉴定其化学结构（图 1）后分别将其命名为桔梗炔苷A、桔梗炔苷B，它们都是党参炔苷的衍生物，表明桔梗中党参炔苷的衍生物广泛存在，因此对桔梗中聚炔类成分含量测定很有意义。《中国药典》2015年版中对桔梗质量控制仅有桔梗皂苷D 1个指标，规定桔梗中桔梗皂苷D含量不得少于0.1%。近年来已有多篇文献报道过测定桔梗中桔梗皂苷D含量[19-20]，这种方法不能完全体现桔梗药材的质量。按照谭玲玲等[21]测定桔梗中桔梗皂苷D的方法对15个不同产地桔梗的含量进行预实验，对比桔梗中3种聚炔类成分含量可以看出，不同产地3种聚炔类化合物总含量和桔梗皂苷D的含量呈正相关，所以建立一种同时测定桔梗中3种聚炔类化合物成分含量的方法很有意义。本实验建立了一种同时测定桔梗中3种聚炔类化合物的HPLC方法，此法简单、准确，重复性好，为将这3种聚炔类化合物作为桔梗药材中新的质量控制指标加以应用奠定了基础。
| [1] |
中华人民共和国药典2015年版. 一部[S]. 2015: 277 ChP 2015. VolⅠ[S]. 2015: 277 |
| [2] |
CHOI JH, SUN WJ, EUN HH, et al. Platycodon grandiflorum root-derived saponins attenuate atopic dermatitis-like skin lesions via suppression of NF-kB and STAT1 and activation of Nrf2/ARE-mediated heme oxygenase-1[J]. Phytomedicine, 2014, 21(8-9): 1053. DOI:10.1016/j.phymed.2014.04.011 |
| [3] |
HWANG YP, CHOI JH, KIM HG, et al. Saponins from Platycodon grandiflorum inhibit hepatic lipogenesis through induction of SIRT1 and activation of AMP-activated protein kinase in high-glucose-induced HepG2 cells[J]. Food Chem, 2013, 140(1-2): 115. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.02.041 |
| [4] |
CHUN J, KIM YS. Platycodin D inhibits migration, invasion, and growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells via suppression of EGFR-mediated Akt and MAPK pathways[J]. Chem Biol Interact, 2013, 205(3): 212. DOI:10.1016/j.cbi.2013.07.002 |
| [5] |
KIM TW, SONG IB, LEE HK, et al. Platycodin D, a triterpenoid sapoinin from Platycodon grandiflorum, ameliorates cisplatin-induced nephrotoxicity in mice[J]. Food Chem Toxicol, 2012, 50(12): 4254. DOI:10.1016/j.fct.2012.05.022 |
| [6] |
RYU CS, KIM CH, LEE SY, et al. Evaluation of the total oxidant scavenging capacity of saponins isolated from Platycodon grandiflorum[J]. Food Chem, 2012, 132(1): 333. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.10.086 |
| [7] |
TAO WW, SU Q, WANG HQ, et al. Platycodin D attenuates acute lung injury by suppressing apoptosis and inflammation in vivo and in vitro[J]. Int Immunopharmacol, 2015, 27(1): 138. DOI:10.1016/j.intimp.2015.05.005 |
| [8] |
TADA H, SHIMOMURA K, ISHIMARU K. Polyacetylenes in Platycodon grandiflorum Hairy root and Campanulaceous plants[J]. J Plant Physiol, 1995, 145(1-2): 7. DOI:10.1016/S0176-1617(11)81838-9 |
| [9] |
AHN JC, HWANG B, TADA H, et al. Polyacetylenes in hairy roots of Platycodon grandiflorum[J]. Phytochemistry, 1996, 42(1): 69. DOI:10.1016/0031-9422(95)00849-7 |
| [10] |
宋丹, 王峥涛, 李隆云, 等. 党参炔苷对胃溃疡模型大鼠胃黏膜损伤保护作用的研究[J]. 中国中医急症, 2008, 17(7): 963. SONG D, WANG ZT, LI LY, et al. Protective effect of lobetyolin on gastric mucosa of experimental gastric ulcer in rats[J]. J Emerg Tradit Chin Med, 2008, 17(7): 963. DOI:10.3969/j.issn.1004-745X.2008.07.048 |
| [11] |
唐晓静, 江涛, 徐斯凡, 等. 党参炔苷对雌性大鼠卵巢颗粒细胞增殖分化的影响及其作用机制[J]. 生殖与避孕, 2015, 35(9): 587. TANG XJ, JIANG T, XU SF. Effects of lobetyolin on ovarian granulose cells' proliferation, differentiation and the mechanism[J]. Reprod Contracep, 2015, 35(9): 587. |
| [12] |
DUMLU MU, GURKAN E, TUZLACI E. Chemical composition and antioxidant activity of Campanula alliariifolia[J]. Nat Prod Res, 2008, 22(6): 477. DOI:10.1080/14786410701640429 |
| [13] |
陈璐, 王天志, 杨兵, 等. 比较和优化党参炔苷的提取工艺[J]. 华西药学杂志, 2008, 23(4): 454. CHEN L, WANG TZ, YANG B, et al. Comparison and optimization of different extraction processes of lobetyolin[J]. West China J Pharm Sci, 2008, 23(4): 454. DOI:10.3969/j.issn.1006-0103.2008.04.031 |
| [14] |
刘同举, 李淑芬, 闵江, 等. 超临界流体萃取党参中党参炔苷的研究[J]. 中国中药杂志, 2009, 34(5): 560. LIU TJ, LI SF, MIN J, et al. Extraction of lobetyolin from codonopsis with supercritical CO2[J]. China J Chin Mater Med, 2009, 34(5): 560. DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2009.05.016 |
| [15] |
冯月, 吴文夫, 魏建华, 等. 正交设计优化党参炔苷提取工艺的研究[J]. 人参研究, 2013(2): 46. FENG Y, WU WF, WEI JH, et al. Optimization of extraction technology of lobetyolin by orthogonal design[J]. Ginseng Res, 2013(2): 46. DOI:10.3969/j.issn.1671-1521.2013.02.014 |
| [16] |
冯彬彬, 张建海, 牛小花, 等. 设计优化庙宇党参中党参炔苷和党参总多糖提取工艺[J]. 中国实验方剂学杂志, 2015, 21(24): 18. FENG BB, ZHANG JH, NIU XH, et al. Optimization of extraction technology of lobetyolin and total polysaccharides from Miaoyu Codonopsis Radix by box-behnken design[J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2015, 21(24): 18. |
| [17] |
黄健, 李洋, 庄志宏, 等. 不同炮制方法对党参中党参炔苷含量的影响[J]. 世界中医药, 2011, 6(4): 351. HUANG J, LI Y, ZHUANG ZH, et al. Effects of different processing methods on the content of lobetyolin in Codonopsis Radix[J]. World Chin Med, 2011, 6(4): 351. DOI:10.3969/j.issn.1673-7202.2011.04.042 |
| [18] |
李成义, 魏学明, 王明伟, 等. 硫熏对党参中党参炔苷含量的影响[J]. 中国现代中药, 2010, 12(12): 11. LI CY, WEI XM, WANG MY, et al. Effect of sulphur fumigation on lobetyolin in Codonopsis Radix[J]. Mod Chin Med, 2010, 12(12): 11. DOI:10.3969/j.issn.1673-4890.2010.12.004 |
| [19] |
王新军, 何念武, 邓寒霜. HPLC法测定不同产地桔梗的桔梗皂苷D含量[J]. 江西农业学报, 2014, 26(8): 57. WANG XJ, HE NW, DENG HS. Determination of content of platycodin D in Platycodon grandiflorum from different areas by HPLC[J]. Acta Agric Jiangxi, 2014, 26(8): 57. DOI:10.3969/j.issn.1001-8581.2014.08.015 |
| [20] |
洪玮, 罗娟, 敏郭, 等. HPLC法测定桔梗药材中桔梗皂苷D的含量[J]. 江西中医药, 2014, 45(2): 59. HONG W, LUO J, GUO M, et al. Determination of content of platycodin D in Platycodon grandiflorum by HPLC[J]. Jiangxi J Tradit Chin Med, 2014, 45(2): 59. |
| [21] |
谭玲玲, 侯晓敏, 胡正海. 不同产地桔梗药材中桔梗总皂苷和桔梗皂苷D的测定[J]. 中草药, 2015, 46(11): 1682. TAN LL, HOU XM, HU ZH. Determination of platycodin in Platycodi Radix from different habitats[J]. Chin Tradi Herb Drugs, 2015, 46(11): 1682. |