枳实（Fructus Aurantii Immaturus），芸香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培变种甜橙（Citrus sinensis Osbenkr）的干燥幼果，为常用中药，其性苦、辛、酸，性微寒，具有破气消积、化痰散痞、理气宽中、行滞消胀的功效^[2-3]。枳实中富含黄酮类化合物（约占20%），而黄酮类化合物又以柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷为主^[3-4]。药理学研究表明, 柚皮苷具有抗炎，抗氧化，抗肿瘤，清除自由基以及抗细胞凋亡等活性^[5-8]，同时还具有防治心脑血管疾病，改善软骨组织细胞等功能^[9-10]，在医药、保健领域具有极大的应用价值；橙皮苷除具有抗氧化，抑菌消炎，抗癌，抗肿瘤等药理作用外^[11]，还作为食品添加剂、果蔬保鲜剂、抗氧化剂被广泛地应用于食品工业；新橙皮苷经氢化后形成新橙皮苷二氢查耳酮，是一种无致癌效果以及低热量的甜味剂，其甜度为蔗糖的1 000倍^[12]，已被EU和FDA批准作为食品添加剂。因此，为充分、合理地开发、利用好枳实中的黄酮类化合物，有必要对枳实中黄酮类化合物的提取工艺进行研究。

目前，枳实中黄酮类化合物的提取方法主要有煎煮法、回流提取法、微波法^[13]、超声法^[14]、加压提取法^[15]等，但这些方法存在一定的不足：如煎煮法和回流提取法提取时间长，效率低；微波法、超声法和加压提取法需要的设备比较昂贵，提取成本高。因此，需要寻找一种高效优质的提取方法来提取枳实中的黄酮类化合物，这对于提高枳实资源的附加值以及利用率具有重要意义。

水热法提取是近年来发展起来的一种新的提取技术^[16-17]。在提取过程中，以水为提取溶剂，通过对密闭的提取体系加热，使水处于亚临界或超临界状态，从而表现出高活性、高传质速率的特点，该方法具有提取时间短、效率高、环境友好等优点。目前，关于水热法提取枳实中黄酮类化合物的研究还未见文献报道。为提高黄酮类化合物的得率，本研究拟采用水热法来提取枳实中的黄酮类化合物，以黄酮类化合物（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）的总得率为评价指标，并利用星点设计-响应面法对该提取方法进行优化，旨在为枳实中黄酮类化合物的提取提供借鉴，同时为枳实药用的深入开发、研究提供参考。

1 仪器与材料

天美LC2000液相色谱仪（上海天美科学仪器有限公司），CT14RD高速离心机（上海天美生化仪器设备有限公司），BT125D双量程电子分析天平（德国多利斯公司），聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜（福建物质结构研究所），PHG9246A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

枳实购自洛阳中药材批发市场（粉碎过80目筛，备用），柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的对照品购于大连美仑生物技术有限公司，纯度为99.0%，甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-水-磷酸（20:80:0.024）；流速：1 mL·min^-1；检测波长：283 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。色谱图见图 1。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的对照品适量，加50%甲醇水溶液制成每1 mL含柚皮苷50 μg、橙皮苷5 μg、新橙皮苷50 μg的混合对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

按照料液比[66:1（mL:g）]将枳实粉末与18 mL水混合于25 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，在50 min、114 ℃条件下加热提取，放至室温。移取2 mL提取液于离心管中，10 000 r·min^-1离心5 min。取上层液100 μL于10 mL棕色量瓶中，50%甲醇水溶液定容，摇匀后过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液1、2、4、6、8 mL，分别置10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇水溶液定容，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品的质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，结果见表 1。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液4 mL，置10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇水溶液定容，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.83%、0.93%、0.89%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同1份供试品溶液，室温避光保存，分别在0、2、8、12、24 h进样分析，计算峰面积的RSD。结果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD分别为1.2%、1.9%、1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称定同一批枳实药材粉末0.36 g，共6份，在110 ℃提取25 min，按“2.3”项下方法制备枳实供试品溶液，计算柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的得率及RSD。结果3个黄酮类化合物的平均得率分别为9.32%、0.70%、8.34%，RSD分别为1.9%、2.2%、1.6%。表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量（柚皮苷含量为15.22 μg、橙皮苷含量为2.01 μg、新橙皮苷含量为14.22 μg）供试品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，分为高、中、低3组，分别加入柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品，每个浓度制备3组，每组样品检测3次，取平均值，计算回收率和RSD。结果见表 2。3个黄酮类化合物的总加样回收率为98.7%，说明方法回收率良好。

3 结果与分析 3.1 单因素试验 3.1.1 提取时间的考察

称取干燥枳实粉末0.45 g，5份，加水18 mL混合，提取温度110 ℃，考察提取时间对枳实中黄酮化合物得率的影响。由图 2可知，在5~45 min内，随着提取时间的延长，黄酮得率逐渐升高；提取时间超过45 min后，继续延长提取时间，黄酮得率无显著变化。由于水热法是在密闭的反应体系中进行的，在此提取条件下，水处于亚临界状态，并且体系内的饱和蒸气压较高，两方面的原因有效地缩短了黄酮类化合物在水中的溶解平衡时间，提高了提取效率。因此，提取时间以45 min左右较为适宜。

3.1.2 提取温度的考察

称取干燥枳实粉末0.45 g，5份，加水18 mL混合，在不同温度下提取45 min。由图 3可以看出，90~110 ℃之间，黄酮的得率随温度的升高逐渐增加，当温度达到110 ℃时，黄酮得率出现了跳跃式升高。可能温度超过100 ℃后，水的状态发生了变化，由普通水转变为了亚临界水，与普通水相比，亚临界水的介电常数、表面张力和粘度都显著降低，水分子间的氢键减弱甚至打开，极性减小^[18]，提高了黄酮类化合物在水中的溶解性和传质系数；同时，温度的升高也致使提取体系内的饱和蒸气压升高，压力的升高有助于提高水对基质的穿透能力，缩短溶剂在基质的进出速度^[19]，从而提高黄酮类化合物的溶出速度。随着温度的继续升高，黄酮得率开始缓慢降低，其原因可能有二：一是黄酮类化合物长时间处于较高的温度和压力下，分解所致；二是较高的温度和压力致使枳实中植物蛋白变性凝结，阻碍了黄酮类化合物的溶出。因此，水热法提取温度宜控制在110 ℃左右。

3.1.3 液料比的考察

称取不同量的干燥枳实粉末6份，固定提取温度为110 ℃，提取时间为45 min。研究液料比对黄酮类化合物得率的影响，结果如图 4所示。从图中能够看出，液料比（mL:g）在30:1~60:1之间时，随着液料比的增大，黄酮得率逐渐升高，主要是由于液料比的增大，增大了枳实粉末与水的接触面积，使提取溶剂水与枳实粉末充分接触，黄酮类化合物的得率不断升高。当液料比超过60:1时，黄酮得率呈缓慢降低的趋势，其原因在于此提取条件下，枳实中黄酮类化合物的提取已趋于完全，继续增大液料比只会对提取液中的黄酮类化合物进行稀释，从而表现为黄酮得率缓慢降低。因此，液料比（mL:g）应在60:1左右为宜。

3.2 水热法提取工艺优化

在单因素试验的基础上，确定提取温度（X₁）、液料比（X₂）、提取时间（X₃）3个因素的水平值，以3个黄酮苷类化合物（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）的总得率（Y）为因变量，运用Design Expert 8.0.6软件进行星点设计和数据分析。具体试验因素和水平值见表 3。

根据星点设计方法原理，采用Design Expert 8.0.6软件设计3因素5水平共19个试验，其中零点重复5个试验。具体响应面分析方案与结果见表 4。利用Design Expert 8.0.6统计软件对表 4中数据进行多项式回归分析，建立枳实药材中黄酮类化合物提取工艺参数的回归模型，得到黄酮类化合物得率对自变量X₁、X₂和X₃二次多项回归方程：

$ \begin{array}{l} Y = 19.62 + 0.16{X_1} + 0.15{X_2} + 0.088{X_3} + 0.19{X_1}\cdot{X_2} + 0.51{X_1}\\ {X_3} + 0.051{X_2}{X_3} - 0.53X_1^2 - 0.18X_2^2 - 0.60X_3^2 \end{array} $

对该模型进行方差分析，对模型系数进行显著性检验，结果见表 5。从表中可以看出，回归模型极其显著（P < 0.000 1），说明建立的模型有意义；失拟项P=0.369 8 > 0.05，无显著性差异，说明模型拟合度良好；模型复合相关系数R²=0.983 9，校正决定系数Adj R²为0.967 8，说明此模型的试验值与预测值非常接近，可用此模型和方程来分析和预测黄酮化合物的总得率。

由回归模型系数显著性检验结果可以看出，模型一次项中X₁（提取温度）、X₂（液料比）和X₃（提取时间）均显著，其中X₁影响程度最为显著；二次项X₁²、X₃²和X₁X₃影响为极显著，X₂²和X₁X₂影响显著。由此可见，各影响因素对黄酮类化合物得率的影响不是简单的线性关系。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，提取温度 > 液料比 > 提取时间。提取温度与提取时间的交互作用对黄酮化合物得率的影响最大，其次为提取温度与液料比的交互作用，液料比与提取时间的交互作用最不显著。

3.3 工艺优化与预测

响应面图是响应值在各试验因素交互作用下得到的结果，可以预测和检验变量的响应值以及确定变量的相互关系。根据回归方程作出模型的响应曲面及等高线（图 5~7）。从图中可以看出，检测范围内3个响应面均为开口向下的凸形曲面，说明黄酮得率存在极大值；3个图的等高线中心均位于-1.732~1.732之间，说明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。同时，响应面曲线走势越陡，表明该因素对提取效果的影响越显著^[20]。从图中可以直观地看出，提取温度对黄酮得率影响最大，其次是液料比，最后是提取时间，与回归分析结果相符。通过Design Expert软件分析，由响应面和等高线图以及回归方程可知，提取枳实中黄酮类化合物的最佳试验条件为提取温度114.05 ℃，料液比1:66.78，提取时间50.49 min，枳实3种黄酮的总提取率预计可达到19.71%。

3.4 验证试验

考虑到实际操作问题，验证时将最佳提取条件微调为提取温度114 ℃、液料比66:1、提取时间50 min。利用修正后的水热法最佳条件，从枳实中提取黄酮类化合物。5次平行验证试验的提取率分别为19.90%、19.82%、19.77%、19.86%、19.76%，平均提取率为19.82%，与预测值的相对误差为0.56%，说明星点设计-响应面法应用于枳实中黄酮化合物提取工艺的优选取得了较好的结果，具有实际应用价值。

4 讨论

中药活性组分的提取通常采用水煎煮法和热醇回流法，但是效率和成本问题，成为制约两者应用的瓶颈。因此，有必要探索和建立新型的提取方法来提取中药中的活性组分，这对中药的开发以及深加工具有重要意义。本文对水热法应用于中药活性组分提取的可行性进行了研究，以枳实中黄酮类化合物的提取为例，通过单因素试验系统探讨了提取温度、液料比以及提取时间对水热法提取黄酮类化合物得率的影响；在此基础上，采用星点设计组合试验，优化了水热法提取条件。结果表明，提取温度为114.05 ℃，液料比为66.78:1，提取时间为50.49 min，黄酮类化合物的得率最高。为方便操作，将提取条件修正为提取温度114 ℃、液料比66:1、提取时间50 min，验证试验结果与模型预测值接近，说明星点设计-响应面法应用于枳实中黄酮类化合物的水热法提取工艺筛选具有可行性，本研究结果为枳实中黄酮类化合物的高效提取以及其药理活性作用的进一步开发提供了可靠的试验基础。同时表明，水热法可应用于中药活性组分的提取，为中药活性组分的提取提供了一种新方法、新思路。