真菌多糖具有强烈的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖及免疫活性作用，是近年来的研究热点，灵芝多糖作为一种常见的真菌多糖而备受关注。2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）规定，灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.exFr.）Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体，全年采收，除去杂质，剪除附有朽木、泥沙或培养基质的下端菌柄，阴干或在40~50 ℃烘干^[1]。灵芝主要成分是多糖和三萜，这也是《中国药典》灵芝项下的主要质控指标，其水提物的主要活性组分为多糖。灵芝提取物是指以赤芝为原料，经提取分离制成的水提物，由于含有灵芝的主要活性成分，目前在药品、保健品、化妆品行业应用广泛。市场上灵芝提取物产品较多，其质量参差不齐，更存在提取过程中掺入糊精或淀粉的现象。《中国药典》及地方标准均未收录灵芝提取物检测方法，2015年版《中国药典》灵芝药材项下采用蒽酮硫酸比色法测定多糖含量，此方法专属性较差，重现性不佳，无法全面反映灵芝提取物中多糖信息。提取灵芝多糖的原料较多，不同的灵芝属真菌，采用子实体或者菌丝体进行提取且提取工艺不同（如水提、发酵等），都会使提取产物存在较大差异。这些差异主要体现在在多糖含量、相对分子质量、化学结构等方面，而采用紫外分光光度法测定总糖无法对以上信息进行区分。若作为药用，规范灵芝提取物来源及生产工艺十分重要，故建立专属性强的灵芝多糖分析方法，对于灵芝提取物的质量控制具有重要意义。

目前植物多糖的研究中，除采用传统比色法测定总糖含量外^[2-3]，单糖组成及相对分子质量的测定也是重点研究内容^[4-5]。单糖组成多采用三氟乙酸全水解，PMP衍生化的方法，运用HPLC紫外检测器进行测定^[6-7]。相对分子质量的测定多采用GPC-RI法^[8-9]，2种方法联合可初步对多糖质量进行专属性的控制，并从侧面反映多糖的结构特征。本研究初步建立了灵芝提取物的单糖组成、重均相对分子质量（M_w）测定方法，并对3批灵芝提取物进行测定，为灵芝提取物中多糖的质量标准提供技术参考。

1 仪器与材料 1.1 仪器

Waters 2790高效液相色谱仪配置紫外检测器，岛津LC-20AD高效液相色谱配置示差检测器及GPC数据处理软件，Wyatt多角度激光光散射检测器。

1.2 材料

甘露糖（Man）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖醛酸（Gal A）、鼠李糖（Rha）、L-岩藻糖（Fuc）9种单糖对照品均购于中国食品药品检定研究院，纯度大于97%；肌醇（Ino），纯度98.5%，Sigma公司；右旋糖苷分子量对照品购于美国Polymer Standards公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）：99%，美国Acros Organics公司；三氟乙酸、盐酸、硫酸、无水乙醇、甲醇、硫酸钠、磷酸二氢钠，磷酸氢二钠、氢氧化钠均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。3批灵芝提取物分别收集于江苏神华药业、中科健康产业集团及福建仙芝楼生物科技公司，编号为S1、S2、S3。

2 方法与结果 2.1 灵芝提取物中粗多糖的提取

精确称取灵芝提取物0.12 g于锥形瓶中，用热水10 mL溶解，再加入乙醇150 mL，充分混合，4 ℃下静置过夜，4 000 r·min^-1离心10 min，弃去上清，下层粗多糖用乙醇反复洗涤，挥去乙醇，作为灵芝粗多糖，待测。

2.2 灵芝提取物中单糖组成及含量测定 2.2.1 对照品溶液的制备

分别取Man、Glc A、Gal、Glc、Xyl、Ara、Gal A、Rha、Fuc 9种单糖和Ino的对照品适量，精密称定，加水制成质量浓度均为1.0 mg·m L^-1的单标溶液。最终根据测定结果，将检出的5种单糖溶液，加水制成浓度为0.1 mg·m L^-1的混合对照品，按照“2.2.3”项下方法进行衍生化，即得混合对照品溶液。

2.2.2 完全酸水解

用热水将粗多糖溶解并转移到50 mL量瓶中，冷却至室温，再用水定容至刻度，摇匀，滤过；精确移取1.0 mL至反应瓶（安瓿瓶）中，加入4 mol· L^-1三氟乙酸1.0 mL，将反应瓶密封，110 ℃下加热4 h。冷却至室温后，60 ℃氮气吹干，再用适量甲醇清洗反应瓶，吹干，反复操作3次。

2.2.3 PMP衍生化

反应瓶中加水0.2 mL，0.15mol· L^-1氢氧化钠溶液0.3 mL，0.1 mol· L^-1的PMP甲醇溶液0.5 mL，盖好瓶盖，70 ℃下加热30 min，冷却至室温。往瓶中加入0.15 mol· L^-1盐酸溶液0.3 mL，充分混匀，用0.45μm的微孔膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.4 HPLC-PDA色谱条件

采用CAPCELL PAK MGII C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为乙腈，流动相B为0.05 mol· L^-1磷酸钠缓冲液（0.05 mol· L^-1磷酸二氢钠与磷酸氢二钠混合水溶液，体积比为12:88），梯度洗脱（0~30 min，85%B→80%B；30~55 min，80%B→75%B；55~56 min，75%B→85%B），检测波长250 nm，柱温35 ℃，流速1.0 mL·min^-1，进样量20µL。

2.2.5 单糖组成测定结果

对样品水解及衍生化，经高效液相紫外检测器测定，得到灵芝提取物单糖组成及含量如表 1所示。

从以上结果可看出，3批灵芝提取物中单糖组成基本一致：所测定的9个单糖中，灵芝提取物粗多糖主要由4个单糖组成，包括Glc、Glc A、Man和Gal，其中2批灵芝提取物检出Fuc，但含量很低，而Ara、Xyl、Rha、GalA及Ino均未检出。从组成含量来看，Glc为灵芝多糖的主要成分，其次为Gal和Man。3批提取物的糖总量在2.6%~6.9%之间。见图 1。

2.3 灵芝提取物多糖M_w的测定 2.3.1 GPC-RI-MALLS色谱条件

色谱柱：Shodex HQ 806+804+803凝胶渗透色谱柱（300 mm×8 mm，7 μm）串联；流动相：0.2 mol· L^-1氯化钠溶液；流速：0.5 mL·min^-1；柱温：40 ℃；进样量：50 μL；检测器：RI与MALLS联用；检测器温度：40 ℃。MALLS激光波长658 nm，石英玻璃样品池。MALLS 90°光电二极管检测器用甲苯校正，其余角度二极管检测器采用M_w=3 000右旋糖酐对照品归一化，dn/dc值为0.14。

2.3.2 对照品溶液的制备

称取11个（M_w分别为180、500、3 000、21 000、44 000、72 000、123 000、325 000、530 000、820 000、3 755 000），用流动相溶解制成10 mg·m L^-1的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

取“2.1”项下提取的灵芝粗多糖加入流动相溶液10 mL使溶解并摇匀，取5 mL置15 mL超滤管（M_w=3 000）中，离心（4 000 r·min^-1）10 min，取截留液（M_w > 3 000）作为供试品溶液，待进样分析。

2.3.4 相对分子质量标准曲线的绘制

分别取不同相对分子质量的对照品溶液在“2.3.1”项条件下测定，采用GPC计算软件绘制标准曲线，得3次方程校正曲线：

$ \begin{array}{l} Y = - 3.958 \times {10^{ - 4}}{X^3} + 6.198 \times {10^{ - 2}}{X^2} - 3.381X + 68.04\;\;\;{r^2} = \\ 0.995\;5 \end{array} $

结果表明，相对分子质量在180~3 755 000范围内线性关系良好。

2.3.5 GPC-RI-MALLS测定结果与分析

按“2.3.1”项下色谱条件，对3批样品采用RI和MALLS串联进行检测，色谱图见图 2。

采用分割峰方式把样品峰分为两部分，分别积分计算M_w。峰1保留时间为35~48 min，峰2保留时间为48.1~60 min。采用右旋糖酐分子量对照品标准曲线计算峰1、峰2的M_w，同时采用MALLS法测定峰1、峰2的M_w，结果如表 2所示。利用RI测定结果对3批样品图谱进行比较，色谱图如图 3所示。

从表 2可看出，峰1的M_w均大于1 000 000，峰所占比例小。峰2不管是MALLS法还是RI法测得M_w均小于46 000，为低分子量部分，峰所占比例大，在91%以上。由MALLS测定的M_w数值均比RI测定的M_w数值高，这可能与测定原理和方法有关，将在讨论部分阐述。

3 讨论 3.1 3批样品多糖测定结果比较

据文献报道，灵芝多糖多由Glc、Gal、Man、Xyl、Rha、Ara、Fuc等组成^[10]。在本次3批样品测定中只出现4~5种单糖，包括Glc、Gal、Man、GlcA和Fuc，而未检出Xyl、Rha、Ara等，这可能与其提取工艺相关。Xyl一般存在于灵芝多糖高分子量端，有可能在灵芝提取过程中对高分子量部分进行处理；Fuc常出现于灵芝菌丝体发酵液中^[11]，故部分批次检出Fuc是否与其生产工艺有关，需进一步考察。从含量上看，测定结果显示Glc含量最高，在所有单糖组成比例达到65%以上，这与灵芝多糖研究报道^[10]相符，即灵芝多糖是β-（1→3）为主链，伴有β-（1→6）支链的葡聚糖结构，葡萄糖为其主要单糖成分，这也是大多真菌多糖的结构特点；其次Gal比例达到11%以上，Gal含量较多的多糖可以显著增加免疫活性，故Gal也应是灵芝多糖的重要指标成分。

分子量测定方面，采用Shodex HQ 806+804+803色谱柱对粗多糖进行分离，得峰1（高分子量部分）和峰2（低分子量部分）。MALLS测定结果显示峰1的M_w均大于1 000 000，峰2的M_w均小于46 000，不同批次灵芝提取物多糖分子量总体分布一致，但从图 3亦可看出多糖含量差异较大。

3.2 RI与MALLS测定结果差异分析

GPC-RI法是一种相对分子质量测定法，需经普适校正才能得到可靠的相对分子质量。此法相对分子质量的计算主要依靠标准曲线，即相对分子质量对保留时间作图所得，而样品在色谱柱上的保留时间不仅与其相对分子质量有关，还与分子的空间结构相关。相对分子质量相同的线性结构和球状结构分子，表观尺寸差异很大，导致保留体积不同，故此法的准确性取决于采用的多糖对照品与实际样品结构是否相似，结构差异大则会造成结果偏离。MALLS法是一种绝对分子质量测定法，不依赖于标准物质，无需做校正曲线；MALLS法亦可由测得的α值推断样品的构象信息，α值在0.2~0.4之间时表明高分子为紧缩的球形构象，在0.5~0.6之间时表示为无规则线团。本试验对灵芝提取物和右旋糖酐对照品的α值进行测定，结果见图 4。从图 4可看出灵芝提取物S1的α值为0.33，与灵芝多糖研究报道^[12]一致，表明其在0.2 mol· L^-1 NaCl水溶液中可能为球形构象，与右旋糖酐存在一定差异，这可能是导致RI与MALLS测定结果不一致的原因之一。另外，本实验采用右旋糖苷对照品，此对照品的最大相对分子质量为3 750 000，大于3 750 000的相对分子质量结果是由标准曲线外推所得，亦可能造成一定偏差。

3.3 灵芝提取物中多糖测定方法

本文对灵芝提取物中多糖的单糖组成及M_w测定方法进行初步研究。通过对3批样品的测定初步得出结论：灵芝提取物中多糖的测定可采用Glc、Gal、Man和GlcA作为定性鉴别指标，并对几种单糖的含量进行检测。此方法相较于传统的蒽酮-硫酸、苯酚-硫酸总糖测定法，准确性、重复性更佳。同时采用GPC-RI-MALLS联用方法对灵芝提取物中多糖的M_w进行测定，规定2个主要色谱峰的M_w范围。本实验研究认为，单糖组成和M_w可作为控制灵芝提取物中多糖质量的有效指标。但本实验仍存在不足，灵芝提取物由于其品种、工艺、发酵等多种因素，都有可能导致其单糖组成和相对分子质量存在差异，此次实验批数较少，应进一步收集来源更为广泛的灵芝提取物进行研究，并对方法的稳定性进行优化和考察。