2018, Vol. 38 
2. 河北医科大学, 石家庄 050017
2. Fourth Hospital of Hebei; Medical University, Shijiazhuang 050017, China
风湿性疾病是一类临床常见病[1]，发病机制不明，化学治疗一般副作用较大，因而临床多采用中成药来治疗[2]。中成药大多显效慢，疗程长，不法商家为谋求暴利，尝试在其中非法添加某些化学药，以达到明显疗效，常见的主要是非甾体抗炎药(NSAIDs)。NSAIDs具有解热、镇痛、抗炎作用，抗风湿效果显著，但长期大剂量给药可导致一系列严重的不良反应，若在不知情的情况下长期服用含有NSAIDs的药物，会给病人身体健康带来潜在危害[3-4]。近年来，抗风湿类中成药中非法添加化学药物的现象引起了广泛关注，国家食品药品监督管理局于2009年颁布了抗风湿类中成药中非法添加化学药品补充检验办法[5]。
抗风湿类中成药中通常含有多种成分，基质极其复杂，常用的分析方法如薄层色谱鉴别、化学鉴别法选择性较差[6-9]；采用色谱法分析时，易出现假阳性结果，其中灵敏度较高的检测手段，对仪器设备的要求较高，且一般需要烦琐的样品前处理步骤[10-18]，因此不适于现场快速筛查。
离子迁移谱(IMS)是基于大气压下在电场中进行气相离子分析的一种检测技术[19]，灵敏度高，分析速度快，且体积小，便携，因而已广泛应用于毒品、爆炸物的快速检测中，目前在药品安全检测方面也有一定应用，但抗风湿类中成药中非法添加化学药物的IMS法检测尚未见报道[20-23]。
本文利用电喷雾-高效离子迁移谱法(ESI-HPIMS法)，对抗风湿类中成药中常见的非法添加药物布洛芬、对乙酰氨基酚、萘普生、吲哚美辛、双氯芬酸钠进行分析，建立了抗风湿类中成药中非法添加NSAIDs类药物的现场快速筛查方法，并对收集到的抗风湿类中成药样品进行了鉴定。
1 仪器与试药Excellims GA2100高效离子迁移谱仪，电喷雾离子源，进样方式为直接进样。VisIon Analysis分析软件(Analysis_2_3_1_23)，BP 211D(Sartorius)电子天平，Milli-Q50超纯水系统。
对照品布洛芬(北京莱耀生物科技有限公司，产品批号100179-201406)、对乙酰氨基酚(北京普天同创生物科技有限公司，产品批号100018-200408)、萘普生(北京莱耀生物科技有限公司，产品批号100198-201205)、吲哚美辛(北京莱耀生物科技有限公司，产品批号100258-200904)、双氯芬酸钠(北京中科质检生物技术有限公司，产品批号100334-200302)，纯度均≥99.8%。甲醇：色谱纯(用于配制对照品溶液)，Fisher公司；分析纯(用于5抗风湿中成药样品成分提取)，天津市永大化学试剂有限公司。
抗风湿类中成药样品：样品1(抗风湿中药偏方)，粉末，处方未知；样品2(曹清华薏辛除湿止痛胶囊)，处方为当归、白芍、白术、薏苡仁、附子、桂枝、乌梢蛇、地龙、牛膝、细辛、甘草；样品3(风湿安泰片)，处方为生川乌、生草乌、马钱子(制)、羌活、乌梢蛇、红花、骨碎补(制)、乌梅、金银花、细辛、红参、鹿茸、黄柏、没药、广地龙、地枫皮、老鹳草、五加皮、续断、麻黄、甘草、槲寄生、淫羊藿、牛膝、桂枝；样品4(腰膝痛胶囊)，处方为白芷、草乌(制)、独活、续断、牛膝、三七、防风、威灵仙、秦艽、川加皮、防己、海风藤、杜仲、土草藓、何首乌、桑寄生、骨碎补、红花、千年健、赤芍、桂枝、扑热息痛；样品5(夏天无胶囊)，处方为夏天无。
2 实验部分 2.1 溶液的配制 2.1.1 对照品溶液称取布洛芬、对乙酰氨基酚、萘普生、吲哚美辛、双氯芬酸钠的对照品各约10 mg，精密称定，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，即得1mg·mL-1的单一对照品溶液，加甲醇依次稀释得到系列浓度的单一对照品溶液，备用。
2.1.2 供试品溶液称取抗风湿类中成药样品1 g(若为胶囊剂则取内容物)，充分研细，精密称定，加入甲醇10 mL，溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品储备液。用甲醇将供试品储备液分别稀释10、25、50倍，作为系列供试品溶液，备用。
2.1.3 阴性样品溶液分别称取经LC-MS检测，不含NSAIDs类非法添加抗风湿类中成药的阴性样品(即样品2、样品3、样品4、样品5)各1 g，混匀，充分研细，分别精密称量，加入甲醇10 mL溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，依次得到阴性样品溶液A、B、C、D。
2.1.4 模拟阳性样品溶液称取4种抗风湿类中成药阴性样品(样品2、样品3、样品4、样品5)各1 g，混匀，充分研细，精密称定，分别精确加入对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸钠、吲哚美辛5种单一对照品适量，制备非法添加质量分数为1%的模拟阳性样品，按照“2.1.2”项下方法制备模拟阳性样品溶液A、B、C、D。
2.2 IMS分析进样前，取校正溶液(100 μg·mL-1柠檬酸)对仪器进行校正，校正完成后，取待测溶液30~40 μL，进行IMS分析。离子迁移谱工作参数如表 1所示。
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表 1 IMS正离子模式检测参数 Table 1 IMS operating conditions in positive mode |
为比较NSAIDs在正负2种离子模式下的响应值，取系列对照品溶液在不同模式下分别进样分析，结果仅在正离子模式下发现NSAIDs的目标峰。在优化的实验条件下，对5个NSAIDs进行分析，NSAIDs单一对照及混合对照的离子迁移谱图分别见图 1、2。由图可见，分析不同组分时，t=5.60 ms处均出现1个强度相对较高的峰，根据ESI-IMS中的离子形成机制[19]可知，t=5.60 ms处的离子为反应物离子，即H+(H2O)x+2。
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1.对乙酰氨基酚(acetaminophen) 2.萘普生(naproxen) 3.布洛芬(ibuprofen) 4.双氯芬酸钠(diclofenac sodium) 5.吲哚美辛(indomethacin) 图 1 5种NSAIDs单一对照(200 μg·mL-1)的IMS图谱 Figure 1 IMS spectrograms of 5 non-steroidal anti-inflammatory drugs |
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1.对乙酰氨基酚(acetaminophen) 2.萘普生或布洛芬(naproxen or ibuprofen) 4.双氯芬酸钠(diclofenac sodium) 5.吲哚美辛(indomethacin) 图 2 NSAIDs混合对照(50 μg·mL-1)的IMS图 Figure 2 IMS spectrogram of mixed standard of 5 non-steroidal anti-inflammatory drugs |
此外，由图 2可见，除布洛芬与萘普生迁移时间接近难以分离外，其余3个化合物彼此分离良好；为消除环境温度、气压等对各组分迁移时间的干扰，常按公式计算约化迁移率如下[24]：
| $ {K_0} = \left( {\frac{{273K}}{T}} \right)\left( {\frac{P}{{760T{\rm{oor}}}}} \right)\frac{{{L^2}}}{{Vt}} $ |
其中，V是迁移管电压，L是迁移管长度，t代表组分迁移时间，P是气压，T代表开尔文温度(单位：K)。由公式可见，当仪器工作条件确定时，约化迁移率K0只与迁移时间t相关。
3.2 真实样品测定取“2.1.2”项下制备得到的供试品溶液，进行IMS分析，除样品1抗风湿中药偏方检出吲哚美辛外(如图 3)，其余样品均未检出5个NSAIDs，结果见表 2。
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图 3 样品1(稀释25倍)的IMS图 Figure 3 IMS spectrogram of sample 1(diluted 25 times) |
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表 2 真实样品测定 Table 2 Analysis of real samples |
取“2.1.3”和“2.1.4”项下阴性样品溶液和模拟阳性样品溶液，进行IMS分析，结果见图 4。同时，本文对5种抗风湿中成药的处方组成进行了梳理，由结果可见，48种常见抗风湿中药材的存在均不会干扰5个NSAIDs的检测，方法专属性良好。
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1.对乙酰氨基酚(acetaminophen) 2.萘普生或布洛芬(naproxen or ibuprofen) 4.双氯芬酸钠(diclofenac sodium) 5.吲哚美辛(indomethacin) A.样品2(sample 2) B.样品3(sample 3) C.样品4(sample 4) D.样品5(sample 5)
图 4 4种阴性样品(    |
取“2.1”项下系列对照品溶液进样分析，S/N=10和S/N=3时分别测得定量下限和检测下限，结果见表 3。
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表 3 NSAIDs稳定性、耐用性考察 Table 3 Investigation of method reproducibility and robustness of NSAIDs |
取5个NSAIDs的对照品溶液进样分析，以峰强度为指标，考察日内和日间精密度，计算RSD，结果见表 3。
3.6 耐用性考察取5个NSAIDs的对照品溶液进样分析，连续6 d进样，分别以峰强度、迁移时间为指标，考察方法耐用性，计算RSD，结果见表 3。
3.7 IMS条件的优化为达到最优的离子化效率，本文对IMS的工作参数进行了考察和优化，所有实验均重复3份。如图 5-A，随着离子源压力和迁移管温度的升高，响应信号增强，在3 kV时离子强度达到最高；但随着源电压继续升高，溶剂分子与待测物竞争增加，响应信号反而变弱。此外，门电压越低，门宽度越大，峰强度越高，但峰同时变宽，灵敏度降低，通过试验确定离子迁移谱的优化条件见表 1。
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A.源电压(source voltage) B.迁移管温度(drift tube temperature) 图 5 IMS参数优化 Figure 5 Optimization of experimental parameters of IMS |
将已有文献发表的不同基质中NSAIDs的测定方法[25-30]与本文所建立的方法进行了比较，见表 4。
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表 4 NSAIDs分析方法比较 Table 4 Comparision of the NSAIDs detection methods |
目前，关于色谱法、质谱或串联质谱法等方法在测定不同复杂基质中NSAIDs的应用已有诸多报道，这些方法定量准确，可靠性高，质谱或串联质谱更是能达到很高的灵敏度。然而，这些检测方法一般都需要冗杂的前处理，分析时间相对较长；此外，某些方法如质谱法常需要精密的仪器设备和专业操作人员，因此不适于现场快速筛查。与这些方法相比，ESI-HPIMS法具有几点优点：①方法简便快速，不需要任何前处理步骤；②方法专属性良好；③仪器体积小，便携，因此适合用于现场筛查。
同时，本文还对比了所建立方法与已有方法的灵敏度，由结果可见，本文所建立的方法检测下限在0.06~0.33 μg·mL-1之间，相比于MS(MS/MS)方法，灵敏度稍差。但实际上，为达到显著的治疗效果，非法添加的量一般较大，有的甚至可以达到mg级别；同时，只有当非法添加量达到一定的量，才会给消费者带来健康危害。在对这些非法添加药品进行检测时，有的方法如MS(MS/MS)甚至需要对样品进行多倍稀释，以防止检测系统过载。通过对真实样品、模拟阳性样品分析可知，本方法的灵敏度足以达到检测需求，不需要采用复杂的前处理步骤来提高方法灵敏度。
然而，IMS主要依靠迁移时间来对化合物进行定性，虽然各样品分子可以根据碰撞面积、核电荷数、分子折合质量不同而实现分离，但本文仅对5个NSAIDs进行了研究，当有多种未知干扰组分存在时，待测组分的迁移时间可能会受到干扰，若需进一步定性，常需要采用LC-MS等专属性更强的方法。
此外，本文还对5个NSAIDs进行了定量研究，结果可见，虽然检出峰的峰面积随待测物浓度增加而增大，但在大多数情况下，两者的线性关系不明显，因此尚不能实现准确定量。与LC/MS法受限于实验室操作相比，本文所建立的筛查方法虽然不能完成精确定量，但不需要前处理即可完成初步定性检测，方法简便快速，且专属性好，因此有望作为监管部门的现场初步筛查手段。
4 结论本文利用ESI-HPIMS，建立了抗风湿类中成药中非法添加5个NSAIDs(布洛芬、对乙酰氨基酚、萘普生、双氯芬酸钠、吲哚美辛)的快速筛查方法，方法简便快速(仅需2~3 min即可完成对样品的测定)；对真实中成药样品、阴性样品、模拟阳性样品分析可见；方法专属性强，不受中成药中复杂基质的干扰。本文所建立的方法简便、快速、灵敏，特异性强，为抗风湿类中成药非法添加的现场筛查提供了一种简便易行的手段。
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