广藿香(Pogostemonis Herba)为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分，具有芳香化浊，和中止呕，发表解暑的功效，用于湿浊中阻，脘痞呕吐，暑湿表证，湿温初起，发热倦怠，胸闷不舒，寒湿闭暑，腹痛吐泻，鼻渊头痛^[1-2]。广藿香原产东南亚等国，我国的广藿香主要由越南、马来西亚等国家引种，均为栽培，现主要分布于广东、海南等地，是我国十大南药之一。广藿香传统商品药材按产地分为石牌广藿香、高要广藿香、海南广藿香(包括湛江产)，但目前市场上流通的主流商品产地主要是广东湛江以及海南万宁地区^[3-5]。《中华人民共和国药典》2015年版以百秋李醇的含量对广藿香进行质量控制^[1]，该方法只针对广藿香的挥发性成分，不能对广藿香药材进行全面有效的质量控制。广藿香中化学成分有多种，主要有黄酮类、苯乙醇苷、萜类和甾体等^[6-8]。本课题组通过对广藿香的水提部位进行化学成分研究，分离得到含量较高的毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、列当苷以及新西兰牡荆苷2，另外通过液质联用指认出广藿香中含有藿香黄酮醇和广藿香酮，其中毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、列当苷属于苯乙醇苷类，新西兰牡荆苷2和藿香黄酮醇属于黄酮类。研究表明，广藿香酮和广藿香中黄酮类具有抗菌活性^[9-11]，苯乙醇苷类化合物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、神经保护、免疫调节、增强记忆等作用^{[6, 12]}。为了提高广藿香药材质量控制水平，建立更加科学、合理的质量标准，本试验采用UPLC对广藿香药材中6个成分进行含量测定，为提高广藿香药材乃至其相关制剂的质量控制方法提供实验依据。

1 实验部分 1.1 仪器与试剂

Waters Acquity UPLC(Ultra-performance liquid chromatography)H-Class超高效液相色谱系统，配有四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、柱温箱、PDA检测器和Empower 3色谱工作站；色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C₁₈(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；KQ250DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，AL204型和AB135-S型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo International Inc.)，Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 试药与药材

对照品毛蕊花糖苷(批号111530-201411，含量以94.4%计算，购于中国食品药品检定研究院)、异毛蕊花糖苷(批号PN1115SB13，含量大于98%，购于上海源叶生物科技有限公司)、藿香黄酮醇(批号X22S7L21715，含量大于98%，购于上海源叶生物科技有限公司)、广藿香酮(批号111822-201102，购于中国食品药品检定研究院)，新西兰牡荆苷2和列当苷为自制(HPLC面积归一化法检测纯度 > 98%)，乙腈(色谱纯)，其他试剂均为分析纯。广藿香药材采于广东省湛江市雷州市英利镇，经石家庄以岭药业股份有限公司药材资源部田清存主任中药师鉴定为广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分。

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品溶液

精密称取毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、藿香黄酮醇、广藿香酮、新西兰牡荆苷2和列当苷的对照品各10 mg，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度约为1 mg·mL^-1单一对照品溶液。精密吸取上述溶液适量，配制成系列浓度的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

取广藿香药材粉碎，过二号筛，取药材粉末1 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入75%甲醇25 mL，密塞，称量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)45 min，取出，放冷，再称量，用75%甲醇补足减失的量，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，过0.22 μm滤膜，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C₁₈(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0~10 min，8%A→14.5%A；10~20 min，14.5%A；20~20.1 min，14.5%A→40%A；20.1~32 min，40%A；32~40 min，40%A→52%A)，流速：0.4 mL·min^-1；柱温：30 ℃；检测波长：309 nm；进样体积：2 μL；运行时间：40 min。上述色谱条件的色谱图见图 1。

2.3 线性关系考察

按上述色谱条件，精密吸取6个不同浓度(新西兰牡荆苷2的质量浓度分别为2.18、10.90、21.80、43.60、54.50和109.00 μg·mL^-1，毛蕊花糖苷的质量浓度分别为8.66、43.31、86.62、173.24、216.54和433.11 μg·mL^-1，异毛蕊花糖苷的质量浓度分别为2.12、10.60、21.20、42.40、53.00和106.00 μg·mL^-1，列当苷的质量浓度分别为1.81、9.04、18.08、36.16、45.20和90.40 μg·mL^-1，藿香黄酮醇的质量浓度分别为0.90、4.50、9.00、18.00、22.50和45.00 μg·mL^-1，广藿香酮的质量浓度分别为1.09、5.42、10.85、21.70、27.12和54.24 μg·mL^-1)的混合对照品溶液各2 μL，注入UPLC仪，检测峰面积，以进样浓度(X，μg·mL^-1)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果见表 1。

2.4 精密度试验

取“2.1.1”项下对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，连续进样6次，测定峰面积，结果新西兰牡荆苷2、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、列当苷、藿香黄酮醇、广藿香酮峰面积的RSD分别为1.6%、1.5%、1.7%、1.5%、1.2%、0.10%，表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h进UPLC分析，测定新西兰牡荆苷2、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、列当苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的峰面积，结果RSD分别为2.7%、2.0%、2.9%、1.6%、1.5%、1.4%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验

取同一批样品粗粉6份，每份1 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.2”项下条件进行分析，结果样品中新西兰牡荆苷2、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、列当苷、藿香黄酮醇、广藿香酮含量的平均值分别为0.825、3.818、1.026、0.823、0.343、0.627 mg·g^-1，RSD分别为2.5%、1.5%、1.6%、1.6%、1.3%、1.3%，表明该方法的重复性良好。

2.7 回收率试验

取已知含量的样品粗粉9份，每份0.5 g，精密称定，按低、中、高浓度(0.8倍、1倍、1.2倍)分别加入一定量新西兰牡荆苷2、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、列当苷、藿香黄酮醇、广藿香酮对照品，按“2.1.2”项下方法制备9份供试品溶液，按“2.2”项下条件进行分析，结果(表 2)表明回收率试验符合要求。

2.8 样品测定

按“2.1.2”项下方法操作，采用“2.2”项下条件对10批药材进行含量测定，结果见表 3。

3 讨论 3.1 流动相和检测波长的选择

本试验比较了乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液2种流动相，通过调整流动相比例，并比较不同流速(0.3、0.4和0.5 mL·min^-1)和不同柱温(25、30和35 ℃)下各待测成分的分离度，最后确定以乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速为0.4 mL·min^-1，柱温为30 ℃时，可以达到满意的分离效果。采用二极管阵列检测器，在210~400 nm波长下对供试品溶液中的待测成分和混合对照品溶液进行了全波长扫描，结果6个待测成分在309 nm处均有较大吸收峰，因此最终选择309 nm作为检测波长，在此波长获得的图谱杂质峰干扰少，各目标峰峰形较好。

3.2 提取方法的选择

本试验比较了不同的提取溶剂，分别为等量的75%甲醇溶液、甲醇、75%乙醇溶液和乙醇，提取方法分别为加热回流和超声提取，提取体积分别为20、25和50 mL，提取时间分别为30、45和60 min，结果表明，以75%甲醇溶液超声提取45 min，提取效率略优，且方法简便，故提取方法确定为1 g药材加入75%甲醇溶液25 mL，超声提取45 min。

3.3 小结

本研究建立了同时测定广藿香中新西兰牡荆苷2、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、列当苷、藿香黄酮醇和广藿香酮的UPLC分析方法，结果不同批次广藿香药材中6个成分的含量差异较大。该方法同时分析了广藿香中不同类别的化学成分，与前期报道的广藿香质量分析方法相比^{[4, 13-18]}，更能全面地反映广藿香药材的质量。经方法验证，所建立的测定方法符合定量分析要求，操作简单，结果准确、可靠，重现性好，可为广藿香药材及其制剂定量控制指标的选择提供参考，为广藿香药材及其制剂的质量标准的建立提供一定的科学依据。