烈香杜鹃(Rhododendron anthopogonoides Maxim)为杜鹃花科常绿灌木，是藏药达里的一种来源植物，俗称黄花杜鹃、小叶枇杷、白香柴等，生长于海拔2 900~4 700 m的高山地区，主要分布在青海、甘肃、四川等地^[1-2]。藏医多以烈香杜鹃的花、叶和嫩枝入药，《月王药诊》记载，“达里主治隆病、赤巴病、培根病”^[2]。现代研究表明，烈香杜鹃具有止咳平喘、祛痰、抗炎、抑菌等药理作用，治疗慢性气管炎的效果显著^[2-3]。

黄酮类成分是烈香杜鹃的有效成分之一^[4]，具有较强的药理活性。近年来的天然药物化学研究表明，烈香杜鹃枝叶中含有槲皮素、异鼠李素、金丝桃苷、槲皮苷等多种黄酮类成分^[4-5]；药理研究也表明，烈香杜鹃中的黄酮类成分具有明显的平喘、抗炎和抑菌等作用^[2-5]。目前，对烈香杜鹃药材的研究主要集中在其挥发油成分的分析及药理作用的研究方面^{[3, 6-9]}，对于多种黄酮类成分的分析^[11-12]及资源合理利用的研究报道较少。

烈香杜鹃作为常用藏药，近年来其用量逐渐增大，但其药材主要来源于野生，为充分利用资源，有必要对烈香杜鹃植株各部位活性成分的分布特征进行研究。本文采用高效液相色谱法，对烈香杜鹃根、老枝、嫩枝、叶和花等不同部位中7个主要黄酮类成分进行分析，说明其分布特征，为烈香杜鹃资源的充分、合理利用和质量控制研究提供参考。

1 材料 1.1 仪器

Waters 515型高效液相色谱仪，配备515双泵、2996二极管阵列检测器、梯度混合器、柱温箱、Empower色谱工作站等。AG135精密电子天平(Mettler Toledo公司，瑞士)，PS-60型洁康牌超声波清洗仪(360 W，40 kHz)(东莞市洁康超声波设备有限公司)，UPT-Ⅱ-20L型超纯水机(成都优普超纯科技有限公司)。

1.2 试药与试剂

对照品金丝桃苷(批号111521-201406)、芦丁(批号100080 -200707)、槲皮素(批号100081-200406)、槲皮苷(批号111538-200403)、木犀草素(批号111520-200504)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；山柰酚(E-0013，批号12120131)和异鼠李素(E-0012，批号14073131)购自上海同田生物技术有限公司，纯度≥98%。甲醇(色谱纯，山东禹王化学试剂厂)，水为自制超纯水(成都优普超纯科技有限公司)，甲酸(色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司)。

1.3 药材

烈香杜鹃样品采自青海省大通县察汗河岸，海拔3 470 m，为盛花期的两株烈香杜鹃完整植株，由中国科学院西北高原生物研究所卢学峰研究员鉴定为烈香杜鹃(Rhododendron anthopogonoides Maxim)。按照根、老枝、嫩枝、叶、花等不同部位分开，切成小段，阴干，粉碎，过60目筛，备用。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

Agilent Exlipse Extend C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)和0.05%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0~10 min，10%A→32%A；10~30 min，32%A；30~38 min，32%A→42%A；38~52 min，42%A→65%A；52~57 min，65%A；57~60 min，65%A→10%A)，流速1.0 mL·min^-1；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量20 μL。色谱图见图 1。

2.2 溶液的配制 2.2.1 对照品溶液

精密称取金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚和异鼠李素的对照品9.15、9.11、6.60、9.32、9.05、7.53、4.51 mg，分别用甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，即得质量浓度分别为0.915、0.911、0.660、0.932、0.905、0.753和0.451 mg·mL^-1的对照品单标储备溶液。根据样品中7个黄酮类成分的含量，分别精密吸取上述对照品单标储备溶液2.0、1.0、0.5、1.0、2.0、0.2、0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，混合均匀后，得到金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚和异鼠李素质量浓度分别为183.0、91.0、33.0、93.0、181.0、15.0、22.5 μg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取样品粉末约1.00 g，准确称量，置100 mL锥形瓶中，加入甲醇30 mL，称量，超声(40 kHz，360 W)40 min，冷却至室温，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀后过滤，滤液经进样分析，确定其中7个黄酮类成分的浓度是否在标准曲线浓度范围内，对溶液浓度不在该范围的采用稀释或减压浓缩的方式适当处理，制备为浓度适宜的供试品溶液。

2.3 标准曲线、线性范围、定量下限及检出下限

取上述混合对照品溶液，采用等倍逐级稀释的方式分别稀释2、4、8、16、32倍，得到标准曲线系列溶液，分别进样20 μL，在“2.1”项色谱条件下分析。以对照品溶液浓度(μg·mL^-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程。以信噪比(S/N)为3和10时的浓度为检出下限(LOD)和定量下限(LOQ)，结果见表 1。

2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液(混合对照品溶液稀释8倍的溶液)20 μL，连续进样6次，按“2.1”项色谱条件分析，金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚和异鼠李素7个黄酮类成分峰面积的RSD分别为2.3%、1.8%、2.5%、2.8%、1.3%、1.6%、2.2%，结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品(烈香杜鹃叶)溶液，分别在第0、4、8、12、24 h进行测定，进样20 μL，按“2.1”项色谱条件分析，得金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚和异鼠李素7个成分色谱峰峰面积的RSD分别为1.9%、2.8%、1.7%、2.6%、2.0%、1.8%、2.6%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验

取同一供试品(烈香杜鹃叶)5份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。7个黄酮类成分金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚和异鼠李素的含量(n=5)分别为5.789、1.371、0.015、0.879 4、1.034、0.047 92、0.100 2 mg·g^-1，RSD分别为0.8%、1.3%、1.7%、0.7%、1.9%、1.1%、1.6%，表明方法的重复性良好。

2.7 加样回收试验

精密称取已知含量的7个黄酮类成分样品粉末(烈香杜鹃嫩枝)6份，每份约0.5 g，分别精确加入金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚和异鼠李素对照品单标储备溶液1.4、1.0、0.1、0.6、0.4、0.1、0.1 mL，再准确加入甲醇26.3 mL，按照“2.2.2”项下步骤制备溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，计算回收率，结果见表 2。

2.8 样品含量测定

精密称取烈香杜鹃5个不同部位样品各1 g，按“2.2.2”项下步骤制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以外标法计算7个黄酮类成分的含量，结果见表 3。

3 讨论 3.1 供试品溶液制备溶剂的选择

根据黄酮类物质的理化性质和文献^[11-12]报道，比较了甲醇、75%甲醇水超声对烈香杜鹃叶中金丝桃苷等7个黄酮类成分提取的效果，当分别采用甲醇和75%甲醇水超声30 min提取时，两者对7个黄酮类成分的提取效果相似。提取时间的优化结果表明，当超声提取时间为40 min时提取率达到最高，随着提取时间的增加，提取液中7个黄酮类成分含量不再增加。所以，将烈香杜鹃中7个黄酮类成分分析时的溶液制备条件确定为用甲醇超声提取40 min。

3.2 检测波长条件选择

黄酮类物质在254 nm和360 nm附近有较大吸收，根据金丝桃苷等7个黄酮类成分在200~400 nm的紫外吸收特征，以及254 nm处响应值高于相应成分360 nm处响应值的特点，确定254 nm作为检测波长。

3.3 不同部位7个黄酮成分分布特征分析

烈香杜鹃的根、老茎、嫩枝、叶和花5个不同部位中7个黄酮类成分的含量呈现出一定的规律性，7个黄酮类成分的总含量，叶 > 嫩枝 > 花 > 老枝 > 根；金丝桃苷、芦丁、槲皮素和木犀草素是其中含量较高的成分，且主要集中分布于嫩枝、叶和花中；槲皮苷主要分布于花中，其他部位含量很低；根中7个黄酮含量远低于其他4个部位，且未检出槲皮苷；花中未检出异鼠李素；嫩枝、叶和花是7个黄酮类成分集中分布的部位。

藏医多以烈香杜鹃的花、叶和嫩枝入药，而《卫生部药品标准藏药(第一册)》中规定^[10]，烈香杜鹃的药用部位为干燥的花和叶。从本实验的数据分析，嫩枝中黄酮类成分含量较高，7个黄酮类成分总含量介于叶和花之间，具有较高的价值，可与叶和花一同作为药用部位。

本研究建立的高效液相色谱法测定烈香杜鹃不同部位(根、老枝、嫩枝、叶和花)中7个黄酮类成分，方法简单可行，重现性好，可为烈香杜鹃药材的质量控制提供参考。7个黄酮类成分在不同部位的分布特征数据能够为充分、合理利用烈香杜鹃资源提供依据。