2018, Vol. 38 
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 102629;
3. 北京三药科技开发公司, 北京 100176
2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629, China;
3. Beijing Sanyao Science & Technology Development Co., Beijing 100176, China
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是由骨基质分泌的1种疏水性蛋白，属于转化生长因子(TGF-β)超家族成员，由Urist等于1965年首次提出，1972年定义，并于1982年首次从脱钙骨基质提取物中分离得到。人们不仅从多种动物骨组织中分离和纯化出天然的BMP-1、BMP-2、BMP-3和BMP-4，而且还通过基因重组技术，进一步在中国仓鼠的卵母细胞和大肠杆菌中表达出了人类基因重组的骨形态发生蛋白(rhBMPs)[1-2]。迄今为止，已经报道了13种BMPs，并且数目仍在继续增加[3]。研究结果表明，在动物生长发育中，BMPs及其相应的受体几乎遍及动物体内所有内脏及体表器官，因此，BMPs的研究已经涉及到胚胎学、发育学、基因学以及进化学等多种学科[4]，其中，BMP-2已成功地用于骨不连的治疗和骨缺损的修复。BMP一般无种属特异性，具有跨种属诱导成骨能力，因而其临床应用前景十分广阔。
在已知的生长因子中，BMP-2的成骨作用最强。已有研究证实，BMP-2对于成骨细胞、软骨细胞的分化以及功能具有重要的调节作用[5-6]，它能跨种属诱导未分化间充质干细胞向成骨细胞方向增殖和分化，促进成骨[7]，使成纤维细胞具有成骨表型[8-9]。然而，由于BMP-2的单独使用会在体液中快速扩散，半衰期短，容易酶解，导致其治疗浓度降低过快，不能持续刺激靶细胞以充分发挥其诱导活性，因此，BMP-2在体内的直接使用有很大的局限性；而通过提高BMP-2的使用剂量来促进成骨，则会因为剂量太高产生一系列并发症，可能导致组织肿胀，产生炎症，促进不期望的异位骨生成，还可在骨痂内形成囊肿样病变[10-17]。所以，目前的研究热点是将BMP-2与载体结合，建立稳定的BMP-2释放系统，从而减少BMP-2的释放，以维持植入位点局部浓度，降低并发症的发生率，使BMP-2能够发挥更大的作用[18]。
BMP参与骨骼的生长、发育及创伤的修复，主要表现为诱导骨形成作用。骨形成是指一组未分化的前体细胞移行到损伤部位，然后在一定的生长因子刺激下定向分化为成骨细胞，合成胶原，形成钙化的骨组织。研究认为，BMP-2主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到募集和分化作用[4]。在骨形成早期，BMP-2不仅可使未分化间质细胞向骨形成中心募集，并分化为骨系细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓的基细胞逆转分化为骨系细胞。其主要过程是：增加或抑制这些细胞内某些特异性蛋白的分泌，使成纤维细胞分化为成骨细胞，成肌细胞快速分化为肥大的软骨细胞，并促进基质钙化。对于成骨细胞，BMP-2则可使之维持其特有细胞表型，并诱导成骨细胞标志物的增高，促进细胞外基质钙化。在骨形成后期，BMP-2还作为一种破骨细胞分化因子，与其他支持破骨细胞分化因子直接或间接刺激破骨细胞分化，参与骨的重建[19-21]。正常骨形成需要3个必备条件：特定的靶细胞群，诱导因子和允许骨形成的微环境。BMP作用的靶细胞是未分化的、有活性的间充质细胞，它能诱导特定的、包括肌肉中和血管周围的间充质细胞不可逆地分化为软骨和骨细胞，所以，骨修复材料中BMP-2的含量就显得尤为重要。BMP-2是骨生成的启动因子，可以加速骨的重建。
我国已有多家医疗器械生产企业成功制备了rhBMP-2，研制各种含BMP-2的骨植入物。含BMP-2的骨植入物中BMP-2的含量测定及活性评价是该类产品质量控制的关键项目。然而，目前针对骨修复材料中BMP-2蛋白含量的直接测定缺乏特异性方法。一般采用的方法为先将骨材料中BMP-2洗脱，再测定洗脱液中BMP-2，而BMP-2洗脱不完全或者很难洗脱下来，造成检测不准确。本课题组采用特异性BMP-2抗体，建立了酶联免疫抑制(ELISA)法，可有效地检测骨植入材料中BMP-2含量。然而，使用目前市售的BMP-2抗体检测骨修复材料中BMP-2蛋白含量，发现抗体存在特异性不好，背景过高等问题。为此，本课题组研究制备了特异性好及效价高的BMP-2单克隆抗体，为骨植入材料中BMP-2含量检测方法的建立奠定了基础。
1 材料与仪器 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物BALB/c小鼠，由金斯瑞生物科技有限公司提供。
1.1.2 实验试剂抗原包被液(pH 9.6碳酸盐缓冲液)：称取碳酸钠0.32 g，碳酸氢钠0.586 g，置于200 mL量瓶中，加水溶解并稀释至200 mL。
磷酸缓冲液(PBS溶液，pH 7.4)：称取氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，磷酸氢二钠1.44 g，磷酸二氢钾0.24 g，加水溶解并稀释至500 mL，121 ℃灭菌30 min。
洗涤液(pH 7.4)：量取PBS溶液1 000 mL，加入吐温-20 0.5 mL，震荡混匀；稀释液(pH 7.4)：称取牛血清白蛋白0.5 g，加PBS溶液溶解并定容至100 mL；封闭液(pH 7.4)：称取牛血清白蛋白3.0 g，加PBS溶液溶解并定容至100 mL；裂解液：含有1%苯甲基磺酰氟(PMSF，1 mmol·L-1，使用前加入)的放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液(P0013B，碧云天)。
其他试剂：rhBMP-2(批号BMP20140201，烟台正海生物科技股份有限公司提供)；rhBMP-2(批号BMP20150109，上海瑞邦生物材料有限公司提供)；兔抗羊IgG-HRP(货号A5420)、兔抗鼠IgG-HRP(货号A9044)、羊抗鼠IgG(货号M8642)，Sigma；BMP-2抗体(货号SC6895)、BMP-2-P抗体(货号SC6895-P)，Santa Cruz Biotechnology，Inc；BMP-2单克隆抗体(货号WH0000650M2)、BMP-4(货号SRP6156)、BMP-5(货号SRP3279)、BMP-7(货号SRP6157)，Sigma；四甲基联苯胺(TMB，货号T8665)，Sigma；RIPA裂解液(货号P0013B)、PMSF(货号ST506-2)，碧云天；亚型检测试剂盒(货号5300-05，SouthernBiotech)；对照抗体：Control Ab-IgG2a，κ，抗体亚型为IgG2a，κ，与BMP-2无反应(货号A00702，GenScript)；HRP标记的抗鼠IgG(H+L)(货号610-1302)，Rockland；HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L) (货号A00160)，GenScript；HAT培养基(货号H0262)，Sigma；IRDye800CW标记的山羊抗小鼠IgG(H+L) (货号925-32210，LI-COR)；脱脂奶粉(货号232100)，碧迪医疗器械有限公司。
1.1.3 实验材料海奥®骨修复材料，烟台正海生物科技股份有限公司。
1.1.4 实验仪器便携式手持匀浆仪(D130，WIGGENS)；离心机(LEGEND MICRO21，Thermo)；酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo)等。
2 方法 2.1 BMP-2单克隆抗体的制备 2.1.1 免疫小鼠的制备使用rhBMP-2蛋白(批号BMP20140201)对5只BALB/c雌性小鼠(1~5号)进行免疫。免疫方法：每只小鼠腹腔中注射50 μg rhBMP-2蛋白/每次，首次免疫使用弗氏完全佐剂，第2次免疫和第3次免疫使用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔2周。
2.1.2 BMP-2抗体阳性血清的筛选经1次免疫、2次免疫、加强免疫后，使用间接酶联免疫吸附方法(ELISA)测定血清BMP-2抗体滴度。具体方法如下：1)包被：使用PBS溶液将rhBMP-2蛋白稀释至1 μg·mL-1，每孔100 μL进行包被，2~8 ℃孵育过夜，第二天使用洗涤液清洗3次；2)封闭：使用PBS溶液稀释牛血清白蛋白至浓度为3%，每孔200 μL进行封闭，37 ℃孵育2 h，使用洗涤液清洗3次；3)加样：加入小鼠不同稀释梯度的血清样品，阴性对照为免疫前血清，空白对照为PBS溶液，加入量为每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后清洗3次；4)加二抗：二抗溶液为使用稀释液稀释的HRP标记的抗鼠IgG (H+L)溶液，稀释倍数为10 000倍，加入量为每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后清洗5次；5)TMB显色：加入TMB溶液进行显色，加入量为每孔100 μL，显色时间为5~8 min；6)终止：显色完成后使用2 mol·L-1硫酸终止反应，使用酶标仪在光密度(OD)450 nm处检测。抗体最大滴度判断标准为样品/空白≥2.1。评价结果中5只小鼠血清均呈阳性，其中1~5号小鼠血清的最大滴度分别为1: 2 000、1: 64 000、1: 512 000、1: 256 000、1: 32 000，结果见表 1。由表 1可知，3号小鼠与4号小鼠血清滴度较高，故选用3号小鼠与4号小鼠进行细胞融合。
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表 1 ELISA法检测血清滴度 Table 1 Serum antibody titer determined by ELISA |
根据上述小鼠血清抗体滴度评价结果，选用3号小鼠与4号小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为3︰1，HAT培养基筛选，共计得到5株阳性细胞株，使用间接ELISA筛选针对rhBMP-2蛋白(BMP20140201)的阳性上清，使用亚型检测试剂盒测定细胞株分泌抗体的亚型，检测结果见表 2。由表 2可知，44F5细胞株效价较高，平行性较好，故选用44F5进行后续试验。44F5细胞株抗体的亚型为IgG2a，κ，目前该细胞株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，编号为CGMCC No.12257。
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表 2 ELISA检测杂交瘤细胞株培养上清液抗体滴度 Table 2 Results of antibody titer in hybridoma culture supernatant determined by ELISA |
将上述筛选后获得的抗体阳性杂交瘤细胞株(44F5)扩大培养，对石蜡致敏后7 d小鼠进行腹腔注射，共2只小鼠，每只小鼠注射5×106个细胞。2周后，抽取腹水，采用常规的Protein G亲和层析介质进行纯化，对纯化后的BMP-2抗体(美坛)进行检测，其结果显示：1、0.5、0.05 μg·mL-1的吸收度均为999(吸收度超出读值范围)；0.005 μg·mL-1的吸收度为0.757；0.000 5 μg·mL-1的吸收度为0.1。纯化后的抗体纯度滴度可达0.005 μg·mL-1，使用SDSPAGE检测纯化后抗体的纯度，抗体纯度 > 90%，结果见图 1。该抗体已由北京三药科技开发公司推广上市。简称为“BMP-2抗体(美坛)”。
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M.蛋白质相对分子质量marker (protein relative molecular mass marker) N.非还原性rhBMP-2蛋白质(non-reductive rhBMP-2 protein，30 000) R.还原性rhBMP-2蛋白质(reductive rhBMP-2 protein，15 000) 图 1 BMP-2抗体纯度检测结果 Figure 1 The purity result of BMP-2 antibody |
通过间接ELISA法检测BMP-2抗体(美坛)与对照抗体的活性。抗体浓度分别为10、1、0.1 μg·mL-1，样品为rhBMP-2(BMP20140201)，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)，空白对照为PBS溶液(检测方法同“2.1.2”项下)。检测结果见图 2，由图 2可知，BMP-2抗体(美坛)与rhBMP-2蛋白具有较高的结合活性，对照抗体与rhBMP-2无结合活性。
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图 2 BMP-2抗体与rhBMP-2蛋白的结合活性 Figure 2 The binding activity of BMP-2 antibody and rhBMP-2 protein |
通过Western blot方法确认BMP-2抗体(美坛)与rhBMP-2(BMP20140201)的结合特性，具体方法如下：1)SDS-PAGE电泳：分别进行还原性电泳和非还原性电泳，胶浓度为15%，样品为rhBMP-2，上样量为每孔0.5 μg。2)电转膜：转模条件为1.0~1.5 mA·cm2凝胶面积，时间为80 min，额定电压为25 V。3)封闭：使用5%脱脂牛奶封闭，2~8℃孵育过夜，封闭完成后使用洗涤液清洗1次，时间为30 min。4)加抗体：分别加入BMP-2抗体(美坛)与对照抗体，抗体浓度为0.5 μg·mL-1，室温孵育1.2 h，孵育完成后使用洗涤液清洗3次，每次10 min。5)加二抗：加入IRDye800CW标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体溶液，抗体浓度为0.1 μg·mL-1，室温孵育40 min后进行检测。检测结果见图 3，由图 3可知，对照抗体与rhBMP-2(BMP20140201)无结合活性，BMP-2抗体(美坛)与非还原状态的rhBMP-2结合，与还原型rhBMP-2无结合，说明BMP-2抗体(美坛)与rhBMP-2结合位点为非线性表位。
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N、M、R.同图 1(same as Fig. 1) 图 3 BMP-2抗体(美坛) (A)与对照抗体(B) Western blot检测结果 Figure 3 The Western blot results of BMP-2 antibody(Meitan)(A) and control antibody(B) |
使用间接ELISA法对比评价BMP-2抗体(美坛)与市售BMP-2抗体(WH0000650M2、SC6895与SC6895-P)的活性。具体方法如下：1)包被：使用包被液将rhBMP-2(BMP20140201)蛋白稀释至1 μg·mL-1，每孔100 μL进行包被，2~8 ℃孵育过夜，第二天使用洗涤液清洗3次；2)封闭：使用PBS溶液稀释牛血清白蛋白至浓度为3%，每孔200 μL进行封闭，37℃孵育2 h，使用洗涤液清洗3次；3)加样：分别加入不同稀释梯度的抗体样品，加入量为每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后清洗3次；4)加二抗：BMP-2抗体(美坛)与市售BMP-2抗体(WH0000650M2)抗体加入兔抗鼠IgG-HRP，市售BMP-2抗体(SC6895、SC6895-P)加入兔抗羊IgG-HRP，均使用稀释液稀释，稀释倍数为10 000倍，加入量为每孔100 μL，37℃孵育1 h，孵育完后清洗5次；5)TMB显色：加入TMB溶液进行显色，加入量为每孔100 μL，显色时间为5~8 min；6)终止：显色完成后使用2 mol·L-1硫酸终止反应，在450 nm下检测其吸收度。
抗体活性检测结果见表 3，由表 3可知，市售BMP-2抗体(WH0000650M2、SC6895-P)与rhBMP-2基本不反应或干扰大，BMP-2抗体(美坛)、市售BMP-2抗体(SC6895)与rhBMP-2可以反应，且呈一定梯度。结果提示，BMP-2抗体(美坛)稀释80 000倍与市售BMP-2抗体(SC6895)稀释1 600倍活性相当，故筛选BMP-2抗体(美坛)与市售BMP-2抗体(SC6895)进行进一步比较。
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表 3 不同BMP-2抗体活性检测结果 Table 3 Activity of different monoclonal BMP-2 antibody |
采用抑制ELISA的方法，将BMP-2抗体(美坛)与市售BMP-2抗体(SC6895)比较，检测含有不同浓度rhBMP-2蛋白(BMP20140201)的骨修复材料复合样品，考察其敏感性。具体方法如下：1)制备rhBMP-2抗原包被板：包被浓度为1 μg·mL-1，每孔100 μL，2~8 ℃孵育过夜，第二天使用洗涤液清洗3次；使用PBS溶液稀释牛血清白蛋白至浓度为3%，每孔200 μL进行封闭，37 ℃孵育2 h后清洗3次；2)制备含BMP-2骨修复材料复合样品：准确称取骨修复材料基质(不含BMP-2蛋白)0.05 g，分别加入浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 μg·mL-1的BMP-2蛋白溶液，然后1: 1体积加入1: 800倍稀释的BMP-2抗体(SC6895)以及1: 40 000倍MP-2抗体(美坛)，室温反应2 h后放置4 ℃过夜，第二天离心后取上清(含抗原-抗体反应过后的剩余抗体)备用；3)加样：在包被好的rhBMP-2抗原包被板内加入上述步骤制备好的含有剩余BMP-2抗体的样品抗原-抗体反应上清液，室温反应1 h后清洗3次；4)加二抗：BMP-2抗体(美坛)反应孔加入兔抗鼠IgG-HRP(A9044)，BMP-2抗体(SC6895)加入兔抗羊IgG-HRP(A5420)，均使用稀释液稀释，稀释倍数均为10 000倍，加入量为每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后清洗5次；5)TMB显色：加入TMB溶液进行显色，加入量为每孔100 μL，显色时间为5~8 min；6)终止：显色完成后使用2mol·L-1硫酸终止反应，使用酶标仪在450 nm下检测吸收度。
结果显示：BMP-2抗体(美坛)曲线R2为0.998，BMP-2抗体(SC6895)抗体曲线R2为0.993，且BMP-2抗体(SC6895)的本底明显高于BMP-2抗体(美坛)的本底，见图 4，说明BMP-2抗体(美坛)的特异性更好，效价更高，应用性优于BMP-2抗体(SC6895)。
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A. BMP-2抗体(美坛)[BMP-2 Ab(Meitan)] B. SC6895抗体(SC6895 Ab) 图 4 抗体敏感性检测结果 Figure 4 The sensitivity results of antibody |
采用抑制ELISA的方法考察BMP-2抗体(美坛)与不同厂家生产的rhBMP-2蛋白[(烟台正海生物科技股份有限公司(批号BMP20140201)及上海瑞邦生物材料有限公司(批号BMP20150109)]的结合特性。rhBMP-2蛋白的包被浓度均为1 μg·mL-1，经封闭液封闭后加入提前制备好的含有不同浓度的BMP-2抗体(美坛)溶液，孵育反应后加入兔抗鼠IgG-HRP进行显色。具体方法同“2.3.2”项下。检测结果见图 5，提示BMP-2抗体(美坛)与不同厂家的rhBMP-2结合良好。
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A.与rhBMP-2(BMP20140201)的结合曲线[binding curve with rhBMP-2 (BMP20140201)，R2=1.000] B.与rhBMP-2(BMP20150109)的结合曲线[binding curve with rhBMP-2 (BMP20150109)，R2=0.996] 图 5 美坛BMP-2抗体特异性检测结果 Figure 5 The specificity results of Meitan BMP-2 antibody |
使用间接ELISA法分别评价BMP-2抗体(美坛)与rhBMP-2(BMP20140201)、BMP-4、BMP-5、BMP-7等BMP蛋白家族的结合活性。具体方法如下：1)包被：使用包被液将rhBMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7蛋白稀释，其中rhBMP-2蛋白稀释至1 μg·mL-1，BMP-4、BMP-5稀释至10 μg·mL-1，BMP-7稀释至50 μg·mL-1，每孔100 μL进行包被，2~8 ℃孵育过夜，第二天使用洗涤液清洗3次；2)封闭：使用PBS溶液稀释牛血清白蛋白至浓度为3%，每孔200 μL进行封闭，37 ℃孵育2 h，使用洗涤液清洗3次；3)加抗体：将BMP-2抗体(美坛)溶液，稀释为80 000倍，加入量为每孔100 μL，37 ℃孵育2 h后清洗5次；4)加二抗：使用稀释液稀释的HRP标记的抗鼠IgG(H+L)溶液，稀释倍数为10 000倍，加入量为每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后清洗5次；5)TMB显色：加入TMB溶液进行显色，加入量为每孔100 μL，显色时间为5~8 min；6)终止：显色完成后使用2 M H2SO4终止反应，在450 nm下检测其吸光度。
结果显示，BMP-2抗体(美坛)可与rhBMP-2发生特异性结合(吸收度1.68)，与BMP家族的BMP-4、BMP-5、BMP-7无反应(吸收度分别为0.05、0.08、0.09)，说明特异性良好。
3 小结本研究通过对小鼠进行免疫，筛选抗体阳性血清，细胞融合等步骤，得到了BMP-2抗体的单克隆细胞株，并进一步纯化得到纯度较高的BMP-2抗体(美坛)。一系列评价结果显示，BMP-2抗体(美坛)的构相为非线性表位，与BMP家族的其他成员无交叉反应，且特异性及活性均优于市售其他BMP-2抗体，能满足检测要求，为骨修复材料中BMP-2的评价以及骨修复材料质量标准的进一步完善奠定了基础。
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