骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)能够诱导动物或人体间充质干细胞分化为成骨细胞，进而形成新生骨^[1]，其中，重组人BMP-2(rhBMP-2)是目前研究最广泛，成骨作用较为明确的一种。然而，rhBMP-2在体液中扩散迅速，半衰期短，容易酶解，治疗浓度降低快，不能持续刺激靶细胞以充分发挥其诱导活性^[2]，因此，目前的研发方向是将rhBMP-2与生物材料复合，材料发挥填充骨缺损、引导骨长入的基础作用，并作为rhBMP-2的释放载体，能有效地发挥rhBMP-2的骨诱导活性，达成理想的骨缺损修复。

将rhBMP-2与生物材料复合的产品属于药械组合产品，这类产品的骨诱导活性取决于rhBMP-2，而rhBMP-2在骨缺损部位的诱导成骨作用呈现剂量相关性。例如在rhBMP-2剂量较低时，在节段性缺损处虽然可以有新生骨形成，但不会达到骨性愈合^[3]；而高剂量的rhBMP-2会导致不良后果，如异位骨形成、移植物移位、骨溶解空腔形成等^[4]，因此，探索并确定骨再生所需的合适的rhBMP-2剂量很有必要。

值得注意的是，当前rhBMP-2和载体材料复合多是将各种载体材料置于一定浓度的rhBMP-2溶液中，通过浸泡吸附，以及冻干等工艺复合。同时通过工艺过程参数的计算，例如通过所使用的rhBMP-2溶液的浓度和体积，计算rhBMP-2含量的理论值，作为载体材料上rhBMP-2的标示值。这种赋值方式并未考虑rhBMP-2和材料的结合受非特异性物理吸附等众多因素的影响，这可能会导致药械组合产品中rhBMP-2实际含量与预期值出现误差。

目前，对组合产品的rhBMP-2定量研究多集中在rhBMP-2释放环节，例如利用直接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法^[5]、近红外荧光团标记rhBMP-2^[6]、125I-rhBMP-2^[7]等研究载体材料的rhBMP-2释放曲线等。Kempen等^[8]制备了包裹rhBMP-2的聚乳酸微球，在将聚乳酸微球溶解后，以解吸附缓冲液抽提，然后用直接ELISA方法测定溶液中的rhBMP-2含量。试验结果发现，对rhBMP-2含量高的聚乳酸微球(8 000 μg·g^-1)，其测定值约为理论值的82%；而对于rhBMP-2含量低的微球(80 μg·g^-1)，其测定值变化大，可能为理论值的8%~78%，因此，可能导致以聚乳酸微球形式负载rhBMP-2的支架，其rhBMP-2实际含量与预期值出现较大偏差。

在组合产品中，由于rhBMP-2与载体材料结合，因而载体材料或其匀浆物将阻碍其负载的rhBMP-2在直接ELISA中与固相底物的反应。本研究针对复合rhBMP-2的骨修复材料，建立了抑制性酶联免疫吸附分析方法，将含rhBMP-2的骨修复材料匀浆后，先与特异性的BMP-2抗体溶液反应，再将剩余抗体与包被的rhBMP-2进行显色反应，骨修复材料对显色反应的抑制程度与其所含的rhBMP-2含量成正比，从而准确测定了组合产品中rhBMP-2的含量。

1 实验材料 1.1 样品

rhBMP-2、复合rhBMP-2的骨修复材料、空白骨修复材料由烟台正海生物科技股份有限公司提供。

1.2 试剂

BMP-2抗体(融合细胞上清液，烟台正海，或者纯化后抗体，美坛70102)，牛血清白蛋白(上海生工，A602440)，吐温20(Sigma，P9416)，酶标二抗(Anti-Mouse IgG (whole molecule)-peroxidase antibody produced in rabbit，sigma，A9044)，四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)显色液(Sigma，T8665)，ELISA分析其他相关试剂如磷酸盐、硫酸等均为国产分析纯试剂；试验所有相关溶液配制均使用纯化水。

1.3 仪器和耗材

便携式手持匀浆仪(D130，WIGGENS)；离心机(LEGEND MICRO21，Thermo)；酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo)等。

2 方法与结果 2.1 优化包被rhBMP-2抗原工作浓度

将rhBMP-2用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释到8、6、4、2 μg·mL^-1进行包被，将BMP-2抗体稀释到2 000倍作为待测样品，用含0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)作为空白对照，然后用相同浓度的酶联二抗进行检测。计算各包被浓度样品吸收度(OD)与其相应空白样品OD的比值(Positive/Negative，P/N)。实验结果见表 1。随着包被浓度的提高，检测样品OD值也升高，但由于非特异性吸附增加，相应的空白样品OD值增大，其P/N值降低，因此将rhBMP-2包被质量浓度定为2 μg·mL^-1。

2.2 ELISA方法的建立

1) 抗原包被：使用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被，rhBMP-2的质量浓度为2 μg·mL^-1，每孔100 μL，室温孵育2 h后4 ℃过夜。用含0.05%的Tween-20的PBS洗板。2)封闭：使用3% BSA封闭，每孔200 μL，37 ℃封闭2 h。3)抗原抗体反应：使用0.5% BSA-PBS稀释液稀释rhBMP-2(10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078 μg·mL^-1)，在微量离心管中准确称取0.05 g骨修复空白材料，每管材料中加入上述系列rhBMP-2溶液300 μL，作为标准样品。取2管骨修复空白材料加入稀释液，作为阴性对照和空白对照，另取0.05 g复合rhBMP-2的骨修复材料，加入0.5% BSA-PBS稀释液300 μL作为供试品。各管匀浆1 min。取BMP-2抗体(1: 1 000，终浓度1: 2 000)300 μL加入标准样品管、阴性对照管与供试品管，空白对照管加入0.5% BSA-PBS稀释液300 μL，室温震摇孵育2 h，之后放置4℃过夜。抗原抗体反应物离心，14 000 g，30 min，取抗原抗体反应上清液备用。4)加样：取上述上清液(含剩余BMP-2抗体)，加入固相抗原包被板中，37 ℃，2 h孵育反应。5)加酶标二抗：使用0.5% BSA-PBS稀释液1: 10 000倍稀释二抗，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后洗板。6)显色与测定：TMB显色，每孔100 μL，室温显色5~8 min。2 mol·L^-1硫酸终止液终止，每孔50 μL。检测读取酶标板450 nm的吸收度值。

2.3 标准曲线的建立

用0.5% BSA-PBS配制倍比稀释的rhBMP-2系列溶液，其在ELISA反应中实际梯度质量浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078 μg·mL^-1，另配制质量浓度为6.667、0.833、0.167 μg·mL^-1的rhBMP-2溶液作为待测样品，并计算待测样品实测值的回收率。以rhBMP-2浓度为横坐标X，吸收度为纵坐标Y，采用四参数方程进行线性回归处理。

3次试验得到的标准曲线相关系数R²分别为0.997 4、0.999 7、0.998 7，表明rhBMP-2在0.078~10 μg·mL^-1质量浓度范围内线性良好。其中1次代表性试验rhBMP-2浓度与吸收度值之间的四参数方程表达式为：Y=1.298 7/[1+(X/7.391 2)×0.645 4]-0.563 4，相关系数R²为0.998 7；待测样品实测值的回收率见表 2。试验结果表明，标准曲线在0.078~10 μg·mL^-1质量浓度范围内能够对各浓度待测样品实现准确检测，其回收率均在理论值的±20%范围内，因此确定本方法的标准曲线范围为0.078~10 μg·mL^-1。

2.4 方法验证 2.4.1 回收率与重复性试验

根据标准曲线选取高(6.667 μg·mL^-1)、中(0.833 μg·mL^-1)、低(0.167 μg·mL^-1)3个质量浓度的rhBMP-2溶液进行考察，每个浓度样品重复测定5次，进行试验的回收率和重复性验证，结果见表 3。验证结果表明，所考察3个浓度的回收率均在理论值±20%范围内，RSD均小于15%。

2.4.2 中间精密度试验

选取高(6.667 μg·mL^-1)、中(0.833 μg·mL^-1)、低(0.167 μg·mL^-1)3个质量浓度的rhBMP-2溶液，每次试验每个浓度样品重复测定5次，重复3次试验，结果见表 4。

2.5 样品检测结果

制备不同rhBMP-2含量(5、10、50 μg·g^-1)的骨修复材料，按相同工艺各制备3批样品用于检测，结果见表 5。检测结果表明，不同含量水平的rhBMP-2实测含量均在理论值±20%范围内，不同批次间含量的RSD均小于15%。

3 讨论与结论

含rhBMP-2骨植入物(药械组合产品)的骨诱导活性依赖于其所含的rhBMP-2。早期获批的产品是将rhBMP-2溶液吸附于胶原海绵后使用，每份产品的rhBMP-2含量为12 mg^[9]，但在随后的临床应用中出现了可能与rhBMP-2及其剂量相关的并发症，如骨溶解、血肿形成等^[10]。因此，探索骨再生所需的rhBMP-2最低有效剂量，并以此优化组合产品的rhBMP-2含量成为解决方式之一。如果将rhBMP-2剂量的优化定义为以较低的剂量达到效果，那临床应用部位和载体材料的选择都将影响剂量的优化水平，可能的载体材料包括胶原、脱细胞骨基质、聚乳酸、磷酸钙基生物陶瓷等。例如，Jung等^[11]发现，在兔颅骨缺损模型中，双相磷酸钙陶瓷负载0.005 mg的BMP-2就能在早期起到促进骨再生的作用，由此可见，检测组合产品中rhBMP-2含量的方法，需要满足rhBMP-2组合产品巨大差异化带来的检测范围、准确性等方面的要求。

在该类组合产品中，由于rhBMP-2与固相载体材料结合，因而载体材料或其匀浆物将影响其负载的rhBMP-2在ELISA中与固相底物的反应。如果采用分离组合产品中rhBMP-2的方式，如盐酸胍^[12]或解吸附液抽提，很可能由于分离不完全导致检测误差^[8]。而且，类似本研究中的rhBMP-2，其N端含有能与胶原结合的寡肽^[13]，能与脱细胞骨基质的胶原形成共价键结合，导致很难将rhBMP-2与载体材料解离。

本研究建立的抑制性酶联免疫吸附分析方法，将含rhBMP-2的骨修复材料匀浆后，先与rhBMP-2抗体溶液反应，再将剩余抗体上清液与包被的rhBMP-2进行显色反应，骨修复材料对显色反应的抑制程度与其所含的rhBMP-2含量成正比。本方法的标准曲线范围为0.078~10 μg·mL^-1，回收率均在理论值±20%范围内，RSD均小于15%。

本抑制性ELISA法解决了在直接ELISA法中，载体材料或其匀浆物对其负载的rhBMP-2与固相底物反应的阻碍。匀浆物负载的rhBMP-2与其抗体能在液相中正常结合。为消除载体材料对试验的影响，在rhBMP-2标准样品管中加入了空白骨修复材料，并且为了控制匀浆对骨修复材料复合的rhBMP-2影响，对rhBMP-2标准样品管和供试品管均进行了匀浆处理。对rhBMP-2标示含量为5、10、50 μg·g^-1的组合产品，采用匀浆后抑制性ELISA法的实测含量均在理论值±20%范围内，不同批次间含量的RSD均小于15%，优于文献[8]报道(rhBMP-2含量为80 μg·g^-1的样品，通过解吸附抽提后进行直接ELISA，其测定值为理论值的8%~78%)的结果。

本研究中的rhBMP-2抗体是通过比较筛选确定的，目前已证实与部分其他组合产品的rhBMP-2也具有良好的反应性，使得应用本抑制性ELISA法测定其他产品的rhBMP-2含量具有可行性。由于rhBMP-2组合产品可能的载体材料还包括胶原、聚乳酸、磷酸钙基生物陶瓷等，因此在测定这些产品时，应使用相应的空白载体材料来消除其对试验的影响，以及使用这些产品自身的rhBMP-2作为标准样品。而接下来将开展对目前国内组合产品的不同rhBMP-2的比较研究，以期能建立抑制性ELISA法的rhBMP-2标准品，这将进一步扩展本方法对其他产品的适用性。