2018, Vol. 38 
由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因具有良好的生物相容性被广泛用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等，但残留抗原仍然是动物源性生物材料造成慢性免疫排斥反应和免疫毒性而影响创伤愈合的重要因素。
研究显示，异种抗原中α-半乳糖基抗原(α-1，3-galactosyle，简称Gal)是动物组织、器官引起超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原[1-2]，广泛存在于牛、猪和其他低等动物体内。Gal主要由α-1，3半乳糖基转移酶(α-1，3-galactosyltransfer ase，α-1，3 GT，或GGTA1)调控[3-5]。人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原[6]，但人血清中存在高滴度的抗-Gal抗体[7-9]，因此，当人体接受含有Gal抗原的组织、器官，或残留有Gal抗原的脱细胞生物材料时会导致超急性免疫排斥反应或者慢性的免疫毒性反应。
由于无法利用野生型低等动物科学地评价Gal抗原相关的免疫毒性反应(狒狒目前数量较少，很难普及使用该动物来考察Gal抗原阳性材料的免疫毒性反应)，因此，如何科学地评价动物源性生物材料的免疫毒性存在着瓶颈。
早在1996年，Tearle等[10]报告了Gal抗原缺失(GGTA1基因敲除，GGTA1 KO)小鼠模型的制作方法。Chiang等[11]报告，Gal抗原缺失小鼠免疫后诱导的抗-Gal抗体与Gal结合的亲和性和人的抗Gal抗体相似，能够诱导Gal抗原阳性异种心脏补片的超急性免疫排斥反应。Chong等[12]报告，Gal抗原缺失小鼠能够诱导自然的抗Gal IgM和IgG，并呈现周龄依存性增强；在同种异体或异种补片移植后可以观察到T-cell依存性的抗Gal抗体反应。Park等[13]报告，与原材料猪源骨相比，经脱Gal抗原处理的猪源骨显著降低了在Gal抗原缺失小鼠中的体液免疫反应，并且引起骨缺损的明显愈合。Choi等[14]报告，将新鲜猪角膜原位植入到Gal抗原缺失小鼠后，发现特异性抗Gal IgM与IgG抗体的沉积显著增多；而将新鲜猪角膜原位植入到野生型小鼠及将脱细胞猪角膜移植到Gal抗原缺失小鼠时，均未发现特异性IgM与IgG抗体的显著沉积。这些研究提示Gal抗原缺失小鼠模型对残留Gal抗原诱导的免疫原性具有敏感的反应性。
修复用生物补片是目前应用较广泛的动物源性医疗器械，本研究采用Gal抗原缺失(GGTA1 KO)模式小鼠，对经脱细胞后的硬脑膜补片医疗器械产品及其原材料牛心包进行免疫原性评价对比研究，评价该产品的潜在免疫反应风险，考察Gal抗原缺失小鼠在硬脑膜补片免疫原性评价中的可行性，为动物源性生物材料免疫原性评价方法的建立提供技术参考。
1 实验材料 1.1 实验动物Gal抗原缺失小鼠，雌性，周龄为9周，15只，平均体重为(22±1.5)g，本课题组研制，由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所模式动物室繁育。
1.2 材料与试剂牛心包与牛心包来源的硬脑膜补片，由冠昊生物科技股份有限公司提供。小鼠IgG ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，货号EMC116)，小鼠IgM检测试剂盒(affymetrix，货号88-50470-22)，羊抗鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology，货号sc-2005)，羊抗鼠IgM-HRP(Santa Cruz Biotechnology，货号sc-2064)，Gal-牛血清白蛋白(BSA，Dextra Laboratories，3-Atom spacer，货号NGP0203)，人血清白蛋白(Sigma，货号A8230-1)，四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB，北京科悦达生物科技有限公司，货号SE1005)，吐温-20(北京索莱宝科技有限公司，货号T8220)，磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone，货号SH30256.01B)，1640培养液(Hyclone，货号SH30809.01)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，货号150119)，细胞因子测试试剂盒(BD Biosciences，货号：558266、558296、560151、558298、558300)，细胞表面抗体测试试剂盒(BioLegend，货号：100305、100707、104507、103132、100412、115512、108910)。96孔酶标板(Costar，货号2592)，终止液(10%硫酸，国药集团化学试剂有限公司，货号7664939)，红细胞裂解液((北京科悦达生物科技有限公司，货号KS801-100)，70 μm细胞筛网(SPL Life Scineces，货号SPL-93070)。甲醛、苏木色精、伊红、酒精、中性树胶、二甲苯均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 设备酶标仪(MD，Spectramax M5)，离心机(Sigma，3k-15)，摇床(太仓豪诚，HZQ-X100)，CO2培养箱(Thermo，150i)，天平(上海民桥，FA1104H)，流式细胞仪(BD Biosciences，LSRII)，生物组织包埋机(科迪仪器设备有限公司，KD-BM)，组织切片机(LEICA，RM2016)。
2 实验方法 2.1 实验动物预免疫处理采用兔(SPF级新西兰大白兔，由中国食品药品检定研究院实验动物生产供应室提供)血红细胞(含有丰富的Gal抗原，简称RRBC)，对Gal抗原缺失小鼠进行预免疫刺激，诱导小鼠体内产生足够的特异性抗-Gal抗体(模拟人体的免疫条件)。每次腹腔注射1×108个RRBC，每隔2周1次，连续2次。
2.2 样品皮下植入第2次RRBC免疫刺激后1周，开始皮下植入试验。小鼠随机分为3组，每组5只。常规1.5%戊巴比妥钠麻醉，备皮，背部约1 cm切口，在小鼠背部皮下分别植入空白对照组(NaCl，简称con，100 μL)、牛心包(T1，1 cm×1 cm)、硬脑膜补片(T2，1 cm×1 cm)，缝合，消毒。
2.3 取材样品植入4周后，小鼠麻醉后用弯头镊子摘小鼠眼球，将眼底血滴入无菌EP管中，3 000 r·min-1离心10 min，得到血清，-80 ℃冻存备用。将小鼠脱颈处死，在75%酒精中浸泡数秒，用无菌纱布擦拭腹部，用手术剪刀剪开腹部，摘取脾脏，去除脾脏上的脂肪组织，放入装有1 640培养液的平皿中，放在无菌工作台中备用。取皮肤及皮下植入材料的局部组织约1 cm×1 cm及胸腺放入盛有10%甲醛溶液的病理杯中。
2.4 血清总IgG、IgM检测 2.4.1 血清总IgG根据小鼠IgG检测试剂盒操作。
2.4.2 血清总IgM根据小鼠IgM检测试剂盒操作。
2.5 血清抗GalIgG、IgM检测 2.5.1 固相抗原包被板制备取2 μg·mL-1的Gal-BSA溶液，每孔100 μL，添加至96孔酶标板中，室温低速摇动2 h，然后4 ℃过夜，洗板3~5次。每孔添加1%人血清白蛋白200 μL至96孔酶标板，置于湿盒，并放入摇床中，37 ℃，100 r·min-1震摇2 h。洗板3~5次。
2.5.2 血清样本制备为了获得合适的吸收度值(一般0.5~1.0为宜)，采用PBS配制小鼠血清系列稀释液：1: 800，1: 1 600，1: 3 200，1: 6 400，1: 12 800。
2.5.3 一抗反应将“2.5.2”项下配制的小鼠血清系列稀释液每孔100 μL，加入到固相抗原包被板中，37 ℃，100 r·min-1，反应2 h。洗板3~5次。
2.5.4 二抗反应采用PBS稀释羊抗鼠酶标抗体IgG、IgM，分别为32 000倍、16 000倍，加入上述固相抗原包被板中，每孔100 μL，37 ℃，100 r·min-1，反应1 h，洗板3~5次。
2.5.5 显色及检测每孔加入TMB显色液100 μL，避光反应15 min，然后每孔加入终止液100 μL，450 nm波长读取吸收度值。
2.6 血清细胞因子检测参考文献[15]，采用细胞因子微球检测技术(Cytometric Bead Array，简称CBA)检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IFN-gama与IL-1beta。
2.7 小鼠脾脏淋巴细胞亚型分析 2.7.1 脾脏淋巴细胞分离将脾脏组织剪碎后放在70 μm细胞筛网上，浸泡于PBS中，用注射器内塞放在培养皿中小心研磨，用PBS冲洗筛网，收集脾细胞。细胞悬液取入15 mL离心管中，300 g离心5 min，去除细胞上清液，加入红细胞裂解液10 mL，裂解红细胞5 min，300 g离心5 min，弃上清液。加入PBS 5 mL重悬细胞，300 g离心5 min，弃上清液。加入适量PBS重悬细胞，计数淋巴细胞，用PBS调节细胞浓度为1×107个·mL-1。
2.7.2 淋巴细胞亚型检测向各流式管中加入相应标记抗体，同时设置阴性对照管。配制10 μL抗体混合体系加入流式管中。用PBS配制细胞浓度为1×107个·mL-1的脾细胞悬液。取100 μL加入各样本的流式管中，充分混合均匀，室温避光反应20 min。每管中加入PBS 2 mL重悬细胞后，300 g离心5 min，离心后弃细胞上清液。每管中加入PBS 0.5 mL重悬细胞后，避光放置待上机检测。
2.8 皮下局部组织和胸腺组织HE染色取皮肤及皮下植入材料的局部组织和胸腺进行蜡块包埋。二甲苯脱蜡每次8 min，共3次；100%酒精作用每次8 min，共2次；90%酒精、80%酒精、60%酒精各作用8 min。苏木素染色4 min，流水清洗。1%盐酸分化2~3 s，流水清洗。0.5%氨水作用20 s，流水清洗，上镜观察。0.5%伊红染色1 min，水洗。80%酒精、90%酒精各脱水3~5 s；95%酒精浸泡5 min；100%酒精浸泡每次5 min，共3次；二甲苯作用每次5 min，共2次。中性树脂胶封固，光镜观察并照相。
2.9 统计学分析所得计量数据以(x±S)表示，采用SPSS 19.0软件进行统计处理，进行多组间单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。
3 结果 3.1 血清总抗体检测结果血清总抗体检测结果见图 1。
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con.对照组(control) T1.牛心包植入组(bovine pericardium implanted group) T2.硬脑膜补片植入组(endocranium patch implanted group) 图 1 小鼠血清总抗体含量(*p < 0.05) Figure 1 Total antibody content in mice serum, *p < 0.05 |
图 1显示：T1(牛心包)组小鼠血清总IgG水平虽明显高于T2(硬脑膜补片)组，但与对照组相比不存在显著性差异；T1组与T2组小鼠血清总IgM水平与对照组相比无显著性差异。
3.2 血清抗-Gal IgG、IgM水平血清抗-Gal IgG、IgM检测结果见图 2。
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con.对照组(control) T1.牛心包植入组(bovine pericardium implanted group) T2.硬脑膜补片植入组(endocranium patch implanted group) 图 2 小鼠血清抗-Gal抗体表达水平 Figure 2 Level of anti-Gal antibody in mice serum |
图 2显示：与对照组相比，T1(牛心包)组小鼠血清抗- Gal IgG水平升高约4倍，抗-Gal IgM水平升高约1.7倍；而T2(硬脑膜补片)组小鼠血清抗- Gal IgG水平，抗-Gal IgM水平与对照组相比无明显变化(P > 0.05)。
3.3 血清细胞因子检测结果血清细胞因子检测结果见图 3。
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con.对照组(control) T1.牛心包植入组(bovine pericardium implanted group) T2.硬脑膜补片植入组(endocranium patch implanted group) 图 3 小鼠血清细胞因子含量(*p < 0.05) Figure 3 Concentration of cytokines in mice serum, *p < 0.05 |
图 3显示：与对照组与牛心包组相比，T2(硬脑膜补片)组小鼠血清IL-4含量明显下降；而牛心包组与对照组相比未出现显著性差异。其余细胞因子包括IL-1β、IL-10、IL-2、IL-6、IL-12P70与IFN-γ含量在各组均无显著性差异。
3.4 脾脏淋巴细胞亚型分析脾脏淋巴细胞亚型分析见图 4。
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con.对照组(control) T1.牛心包植入组(bovine pericardium implanted group) T2.硬脑膜补片植入组(endocranium patch implanted group) 图 4 小鼠脾脏淋巴细胞亚型分析(*p < 0.05) Figure 4 Analysis of spleenic lymphocyte subtypes in mice, *p < 0.05 |
图 4显示：T细胞亚型标记物CD3+、(CD3+ CD4+)与NK细胞亚型标记物(CD3-CD49b+)，在T2(硬脑膜补片)组明显高于T1(牛心包)组，但与对照组相比无显著性差异。B细胞亚型标志物(CD3-CD19+)，在T2组明显低于T1组，但与对照组相比无显著性差异。
3.5 皮肤局部组织和胸腺病理结果皮肤局部组织和胸腺病理见图 5。
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con.对照组(control) T1.牛心包植入组(bovine pericardium implanted group) T2.硬脑膜补片植入组(endocranium patch implanted group) 图 5 小鼠皮肤局部组织(A)和胸腺(B)病理结果 Figure 5 Pathology results of local skin(A) and thymus(B) of mice |
图 5显示：T1(牛心包)组真皮下可见植入物包囊，囊内可见红染呈波纹状的胶原膜片，周围可见由成纤维细胞、纤维细胞及胶原纤维包绕的囊壁，伴有少许淋巴细胞，吞噬细胞浸润，偶见中性粒细胞，炎症波及皮下脂肪结蹄组织。炎症分级：Ⅱ级，纤维化分级：Ⅰ-Ⅱ级。与对照组相比，胸腺未发现明显异常。T2(硬脑膜补片)组真皮下可见植入物包囊，囊内为红染呈条索状的胶原束，不含细胞，囊壁由多层纤维细胞、胶原纤维包绕而成，囊壁与囊周可见淋巴细胞，吞噬细胞浸润，呈带状分布，偶见中性粒细胞。炎症分级：Ⅰ-Ⅱ级，纤维化分级：Ⅰ-Ⅱ级。与对照组相比，胸腺未发现明显异常。
4 讨论本研究采用课题组前期研制的Gal抗原缺失(GGTA1 KO)模式小鼠，通过对脱细胞后的硬脑膜补片(Gal抗原含量为(1.50±0.20)×1013个抗原表位·mg-1)及脱细胞前的牛心包(Gal抗原含量为(2.62±0.53)×1015个抗原表位·mg-1)进行免疫原性反应对比研究，评价脱细胞硬脑膜补片的残留免疫原性风险，考察Gal抗原缺失小鼠在评价动物源性生物材料免疫原性中的应用价值，为动物源性医疗器械的科学审评提供技术支持。
研究结果提示，小鼠血清总IgG、IgM在原材料组与对照组相比未出现显著性差异；T细胞亚型标记物CD3+、(CD3+CD4+)、NK细胞亚型标记物(CD3-CD49b+)与B细胞亚型标志物(CD3-CD19+)，上述指标在硬脑膜补片组与牛心包组相比虽然出现显著性差异，但与对照组相比均无显著性差异，可能与样品的个体差异有关。这些指标不能充分反映动物源性生物材料异种特异性抗原的免疫毒性，因此，不是评价动物源性生物材料脱抗原处理工艺有效性的特异性指标。与对照组相比，原材料(牛心包)组小鼠血清抗-Gal IgG和抗-GalIgM水平显著升高(分别为约4倍和约1.7倍)，而硬脑膜补片产品组与对照组相比则无显著性变化。这些结果与各样品的Gal抗原含量呈正相关性(原材料组的Gal抗原含量显著高于产品组)，充分证明Gal抗原缺失小鼠血清抗-Gal IgG、抗-GalIgM能够科学地评价动物源性生物材料异种特异性抗原的免疫原性，因此，可以作为动物源性生物材料脱抗原处理工艺有效性的特异性指标之一；同时，也证明了Gal抗原缺失小鼠对于动物源性生物材料的异种免疫原性风险评价具有极高的应用价值。其他免疫排斥反应的功能性指标，如细胞因子、脾脏淋巴细胞分型等没有出现显著变化，可能与评价终点时(植入4周)材料的免疫原性特点，抗原没有得到充分暴露与释放等因素有关。根据材料的体内降解特性，有必要继续考察植入材料充分降解过程中的免疫毒性反应(包括上述功能性指标的变化)，进一步评价其免疫原性风险。
在局部病理上，硬脑膜补片组与牛心包组相比，其炎症反应有一定程度的减轻。与上述体内植入结果相比，体外Gal抗原含量检测结果表明：经脱细胞后的硬脑膜补片的Gal抗原含量[(1.50±0.20)× 1013个抗原表位·mg-1]与牛心包原材料Gal抗原含量[(2.62±0.53)×1015个抗原表位·mg-1]相比，下降了99%。因此，本研究采用Gal抗原缺失小鼠间接证明了用于制备硬脑膜补片的脱抗原工艺的有效性及与体外Gal抗原含量检测结果的一致性。但是，随着材料在小鼠体内的降解，释放的Gal抗原可能增多，需要进一步考察残留免疫原引起的Gal抗原相关的慢性免疫反应相关指标的变化。
本研究中，T2(硬脑膜补片)组小鼠血清IL-4含量与对照组和牛心包组相比明显下降，似乎与Gal抗原无关，因为T2组的Gal抗原更低，比牛心包组降低了99%。有研究报告，将猪小肠粘膜下层-细胞外基质(SIS-ECM，不含细胞)植入到T细胞缺失型小鼠体内，未发现IL-4的表达；而将SIS-ECM植入到野生型小鼠体内，则有IL-4 mRNA的表达，因此该研究表明，T细胞是促进SIS-ECM植入小鼠体内IL-4高表达的原因[16]。IL-4主要由活化T细胞产生，硬脑膜补片组小鼠的IL-4含量下降，与活化T细胞标志物(CD3+CD69+)的下降趋势(与对照组和牛心包组相比，但不存在显著性差异)具有一定的相关性，提示T细胞的活化受到了一定的抑制。目前IL-4在移植免疫中的作用尚不明确。IL-4主要作用体现在促进体液免疫和抑制细胞免疫，有研究认为，其表达增高有利于免疫耐受的建立[17-18]，但有的研究结果则相反[19]。
本研究利用Gal抗原缺失模式小鼠，在样品植入实验前利用含Gal抗原丰富的RRBC进行了预免疫刺激，使其产生足够的抗-Gal抗体，在此基础上进行动物源性试验样品的植入。人体内抗Gal抗体主要有IgG型和IgM型，健康人体中以抗Gal-IgG型抗体为主。由于人体内高水平的抗Gal抗体源于含Gal抗原物质的肠道细菌的长期刺激[20]，同样的机理，幼龄的Gal抗原缺失小鼠体内表达非常弱的抗-Gal抗体，随着周龄的增加，经含Gal抗原物质的肠道细菌刺激体内抗-Gal抗体水平逐渐升高，但是其表达水平远远低于人体的表达水平。根据本课题组实验室数据，人血清(AB型血液)中抗Gal-IgG抗体的含量在800倍稀释时吸收度值为1.2，而Gal抗原缺失(GGTA1基因敲除)小鼠其血清在50倍稀释时吸收度值约0.35(背景值约0.2)，在RRBC免疫刺激后50倍稀释时吸收度值约1.3。对比可以得出：人血清抗Gal-IgG抗体的含量是Gal抗原缺失小鼠RRBC免疫刺激后抗Gal-IgG抗体含量的约16倍。人血清(AB型血液)中抗Gal-IgM抗体的含量在10倍稀释时吸收度值(0.72)，与Gal抗原缺失小鼠其血清在50倍稀释时吸收度值(约0.7，背景值约0.4)相当，高于小鼠抗Gal-IgM抗体含量约5倍；Gal抗原缺失小鼠在RRBC免疫刺激后抗Gal-IgM抗体升高了32倍(甚至更高)。由此可见，虽然抗Gal抗体类型分布在Gal抗原缺失小鼠血清(以IgM型为主)与人血清(以IgG型为主)之间可能存在差异(尚需进一步验证)，但是Gal抗原缺失小鼠总的抗Gal抗体水平还是远低于人体的水平。而Gal抗原缺失小鼠RRBC预免疫刺激后总抗Gal抗体水平与人体更接近，因此提示了Gal抗原缺失小鼠RRBC预免疫刺激后应用于动物组织或者动物源性生物材料残留免疫原性评价的必要性和意义。本研究采用RRBC预免疫处理的Gal抗原缺失小鼠，在含Gal抗原丰富的牛心包样品植入后，4周时就出现了显著的特异性抗-Gal抗体的升高；而在本课题组的前期实验中，采用未预免疫处理的Gal抗原缺失模式小鼠，在皮下植入心包样品2周与4周时未出现抗-Gal抗体的显著性升高。本研究表明，Gal抗原缺失小鼠在RRBC预免疫刺激后，明显提高了其对Gal抗原阳性生物材料的敏感性。这些结果为动源性生物材料的异种免疫原性风险评价试验方案的优化和推广应用提供了基础数据支持。
在本课题组的前期实验中，采用未经RRBC刺激的Gal抗原缺失小鼠，在皮下植入心包样品2周与4周时未出现抗-Gal抗体的显著性升高；在植入后3个月时，才出现了特异性抗-Gal抗体的明显升高。分析其原因，可能由于心包组织含大量胶原蛋白，结构比较致密，降解较慢，因此，在植入早期释放的Gal抗原较少，加上实验动物的敏感性不足，所引起的免疫反应不明显；而随着植入时间的延长，样品在体内逐渐发生降解，Gal抗原释放增多，同时实验动物的敏感性也随着周龄的增加而增强，因而引起的免疫反应更加明显。这就提示在评价动物源性生物材料的免疫原性反应时，应结合材料在体内的降解特性，评价其降解周期内的免疫原性风险的动态变化，综合判断这些风险是否可接受。
5 小结本研究在经RRBC预免疫的Gal抗原缺失小鼠皮下分别植入硬脑膜补片(脱细胞后)与牛心包(脱细胞前)4周，考察小鼠血清总抗体水平、抗-Gal抗体水平、血清炎症因子表达水平、脾脏淋巴细胞亚型及局部病理分析。研究结果表明，动物源性硬脑膜补片产品的Gal抗原介导的免疫原性反应显著降低，与对照组相比无显著性差异。在动物源性生物材料的免疫原性评价实验方案中，尤其是针对膜类生物材料，可采用经RRBC预免疫刺激后的Gal抗原缺失小鼠作为动物模型；同时，应结合材料在体内的降解特性，评价其降解周期内的免疫原性风险的动态变化，综合判断这些风险是否可接受。
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