2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因具有良好的生物相容性，被广泛用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等，然而，动物源性生物材料或异种器官组织应用于人体所带来的免疫学问题，直接影响着这类材料使用的安全性和有效性。如异种器官组织植入引起的超急性免疫排斥反应，其发生时间在异种移植后的几分钟至数小时，异种器官在短时间内发生功能衰竭致移植失败。动物源性生物材料虽经各种去除抗原的处理，但却难以彻底去除所有的异种抗原，残留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反应和免疫毒性而影响创伤愈合的重要因素。
研究显示，异种抗原中的α-半乳糖基抗原(α-1，3-galactosyle，简称Gal)是动物组织、器官引起超急性免疫排斥反应的主要靶抗原[1-2]。Gal抗原是含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于牛、猪和其他低等动物体内，其合成由α-1，3半乳糖基转移酶(α-1，3-galactosyl transferase，α-1，3 GT，或GGTA1)或/和异红细胞糖苷酯合成酶(isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside 3 synthase，iGb3S)调控[3-5]。人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原[6]，但人血清中存在高滴度的抗-Gal抗体(占总血清球蛋白的1~3%)[7-9]，因此，当人体接受含有Gal抗原的组织、器官，或残留有Gal抗原的脱细胞生物材料时，会导致超急性免疫排斥反应或者慢性的免疫毒性反应。
由于野生型低等动物都表达Gal抗原，因此无法利用野生型低等动物科学地评价Gal抗原相关的免疫毒性反应。而目前狒狒的数量较少，使用该动物来考察Gal抗原阳性材料的免疫毒性反应很难普及，因此，如何科学地评价动物源性生物材料的免疫毒性存在着瓶颈。
早在1996年，Tearle等[10]就报告了GGTA1基因敲除(GGTA1 KO)小鼠模型的制作方法。该小鼠出生后随着周龄的增加，在肠道细菌Gal抗原的不断刺激下，体内抗-Gal抗体的水平逐渐增高，其抗-Gal抗体与Gal抗原的亲和性与人体相似[11]。许多文献介绍了以GGTA1 KO小鼠作为动物模型开展的异种补片、猪源生物骨、猪源角膜等动物源性生物材料的免疫原性研究[11-14]，这些研究提示GGTA1 KO模型小鼠对Gal抗原诱导的免疫原性具有敏感的反应性。有研究显示，GGTA1基因敲除不能完全消除Gal抗原的表达[15-16]。当GGTA1基因敲除猪的组织器官移植到狒狒体内时，虽然避免了超急性免疫排斥反应，但是最终还是被排斥[17-18]。
本课题组完成了GGTA1和iGb3S单基因敲除及2个基因同时敲除的小鼠模型制备，并发现GGTA1和iGb3S单基因敲除的小鼠都有不同程度的α-Gal抗原表达的下降，但不能使Gal抗原全部消失，其中GGTA1基因的缺失引起α-Gal抗原98.45%~99.77%的下降，起主要调控作用；而iGb3S基因的缺失仅引起α-Gal抗原8.31%~21.74%的下降(英文论文投稿中)。2个基因同时敲除的小鼠达到了Gal抗原的完全缺失，首次揭示了GGTA1和iGb3S在α-Gal抗原表达中的实际参与程度。GGTA1/iGb3S DKO小鼠与GGTA1 KO小鼠相比，对评价外来Gal抗原引起的免疫原性是否更加敏感？目前尚无任何文献报道。
为考察2种Gal抗原缺失小鼠(GGTA1 KO小鼠与GGTA1/iGb3S DKO小鼠)对外来抗原刺激的免疫学反应特性，分析其用于Gal抗原阳性材料免疫毒性评价的敏感性，本研究拟采用含有丰富Gal抗原的兔血红细胞(RRBC)作为外来抗原，免疫刺激2种Gal抗原缺失小鼠，综合考察小鼠免疫学指标的变化，为筛选适合于动物源性生物材料免疫原性风险评价的敏感动物模型提供支持。
1 实验材料 1.1 试验动物GGTA1 KO小鼠(12只，简称KO小鼠)与GGTA1/iGb3S DKO小鼠(12只，简称DKO小鼠)，周龄均为6周，雌雄各半。试验动物由本课题组研制，由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所模式动物室协助繁育。
1.2 主要试剂与耗材羊抗鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology，货号sc-2005)，羊抗鼠IgM-HRP(Santa Cruz Biotechnology，货号sc-2064)，Gal-牛血清白蛋白(BSA，Dextra Laboratories，3-Atom spacer，货号NGP0203)，人血清白蛋白(Sigma，货号A8230-1)，四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB，北京科悦达生物科技有限公司，货号SE1005)，吐温-20(北京索莱宝科技有限公司，货号T8220)，1640培养液(Hyclone，货号SH30809.01)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，货号150119)，细胞因子测试试剂盒(BD Biosciences，货号：558266、558296、560151、558298、558300)，细胞表面抗体测试试剂盒(BioLegend，货号：100305、100707、104507、103132、100412、115512、108910)，磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone，货号SH30256.01B)，96孔酶标板(Costar，货号2592)，终止液(10%硫酸，国药集团化学试剂有限公司，货号7664939)，红细胞裂解液((北京科悦达生物科技有限公司，货号KS801-100)，70 μm细胞筛网(SPL Life Scineces，货号SPL-93070)。
1.3 主要设备酶标仪(MD，Spectramax M5)，离心机(Sigma，3k-15)，摇床(太仓豪诚，HZQ-X100)，天平(上海民桥，FA1104H)，流式细胞仪(BD，LSRII)。
2 试验方法 2.1 小鼠免疫刺激采用兔(SPF级新西兰大白兔，由中国食品药品检定研究院实验动物生产供应室提供)血红细胞(含有丰富的Gal抗原，简称RRBC)，对2种不同基因敲除小鼠进行免疫刺激，每次腹腔注射1×108个RRBC，每隔2周1次，免疫次数分别为0、1、2次(每组4只小鼠)。
2.2 取材在小鼠免疫刺激周期结束后1周，麻醉下眼部采集血液，3 000 r·min-1离心10 min，收集血清，-80 ℃冻存备用。将采血完毕的小鼠脱颈处死，在75%酒精中浸泡消毒后，用手术剪刀剪开腹部，摘取脾脏，去除脾脏上的脂肪组织，放入装有1640培养液的平皿中，放在无菌工作台中进行脾脏淋巴细胞分离。
2.3 血清抗Gal IgG、IgM检测 2.3.1 固相抗原包被板制备取2 mg·mL-1的Gal抗原(Gal-BSA)溶液，每孔100 μL，添加至96孔酶标板中，室温低速摇动2 h，然后4 ℃过夜，洗板3~5次。每孔添加1%人血清白蛋白200 μL至96孔酶标板，置于湿盒，并放入摇床中，37 ℃，100 r·mim-1震摇2 h。洗板3~5次后4 ℃保存备用。
2.3.2 血清样本制备为了获得合适的吸收度值(一般0.5~1.0为宜)，采用PBS配制合适的小鼠血清系列稀释液，稀释倍数包括：1: 12.5，1: 25，1: 50，1: 100，1: 400，1: 800，1: 1 600，1: 3 200，1: 6 400。
2.3.3 一抗反应取“2.3.2”项下配制的小鼠血清系列稀释液每孔100 μL，加入到固相抗原包被板中，37 ℃，100 r·min-1，反应2 h。洗板3~5次。
2.3.4 二抗反应采用PBS分别稀释羊抗鼠IgG、IgM 32 000倍、16 000倍后，分别加入上述固相抗原包被板中，每孔100 μL，37 ℃，100 r·min-1，反应1 h，洗板3~5次。
2.3.5 显色及检测每孔加入TMB显色液100 μL，避光反应15 min，每孔再加入终止液100 μL，450 nm波长读取吸收度值。
2.4 血清细胞因子检测参考文献[19]，采用细胞因子微球检测技术(Cytometric Bead Array，简称CBA)检测细胞因子IL-4，IL-12p70与IFN-gama。
2.5 小鼠脾脏淋巴细胞亚型分析 2.5.1 脾脏淋巴细胞分离将脾脏组织剪碎后，放在70 μm细胞筛网上，浸泡于PBS中，用注射器内塞放在培养皿中小心研磨，用PBS冲洗筛网，收集脾细胞。将细胞悬液300 g离心5 min，去除细胞上清液，加入红细胞裂解液10 mL，5 min后300 g离心5 min，弃上清。加入PBS 5 mL重悬细胞，300 g离心5 min，弃上清。再次加入适量PBS重悬细胞并计数淋巴细胞。
2.5.2 淋巴细胞亚型检测向各流式管中加入相应标记抗体，同时设置阴性对照管。配制10 μL抗体混合体系加入流式管中。用PBS配制细胞浓度为1×107个·mL-1的脾细胞悬液。取100 μL加入各样本的流式管中，充分混合均匀，室温避光反应20 min；每管中加入PBS 2 mL重悬细胞后，300 g离心5 min，弃细胞上清液。每管中加入PBS 0.5 mL重悬细胞后，避光放置待上机检测。
2.6 统计学分析所得计量数据以(x±S)表示，采用SPSS 19.0软件进行统计处理，多组间行单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。
3 结果 3.1 血清抗-Gal IgG水平
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A：KO.未经免疫刺激的GGTA1 KO小鼠(GGTA1 KO mice without RRBC pre-immunization) KO+RRBC (one time).免疫刺激1次(pre-immunization for one time) KO+RRBC(two times).免疫刺激2次(pre-immunization for two times) B：DKO.未经免疫刺激的GGTA1/iGb3S DKO小鼠(GGTA1/iGb3S DKO mice without RRBC pre-immunization) DKO+RRBC(one time).免疫刺激1次(pre-immunization for one time) DKO+RRBC(two times).免疫刺激2次(pre-immunization for two times) 图 1 小鼠血清抗-Gal IgG表达水平 Figure 1 Anti-Gal IgG level in serum of mice |
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表 1 小鼠血清抗-Gal IgG表达水平(吸收度，n=4) Table 1 Anti-Gal IgG level in serum of mice (absorbance value, n=4) |
图 1及表 1显示：与无RRBC免疫刺激组相比，DKO小鼠血清抗-Gal IgG水平经1次免疫刺激后升高约1.7倍，2次免疫刺激后，升高约41倍；与无RRBC刺激组相比，KO小鼠血清抗-Gal IgG水平经1次RRBC免疫刺激后升高约3.1倍，2次免疫刺激后升高约92倍。
3.2 血清抗-Gal IgM水平|
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表 2 小鼠血清抗-Gal IgM表达水平(吸收度，n=4) Table 2 Anti-Gal IgM level in serum of mice (absorbance value, n=4) |
图 2及表 2显示：与无RRBC刺激组相比，KO小鼠血清抗-Gal IgM水平经1次RRBC免疫刺激后升高约2.3倍，2次免疫刺激后升高约407倍；与无RRBC免疫刺激组相比，DKO小鼠血清抗-Gal IgM水平经1次免疫刺激后升高约5.8倍，2次免疫刺激后升高约184倍。
3.3 血清细胞因子检测结果血清细胞因子检测结果见图 3。
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con.未经RRBC免疫刺激的小鼠(mice without RRBC pre-immunization)RRBC (one time).经1次免疫刺激的小鼠(RRBC (one time)：mice with pre-immunization for one time) RRBC (two times).经2次免疫刺激的小鼠(RRBC (two times)：mice with pre-immunization for two times) 图 3 小鼠血清细胞因子含量 Figure 3 Cytokines expression levels in mice |
图 3显示：经RRBC刺激前后(包括不同次数)，2种Gal抗原缺失小鼠的细胞因子(包括IFN-gama，IL-4与IL-12P70)表达水平均不存在显著性差异。
3.4 脾脏淋巴细胞亚型分析KO小鼠脾脏淋巴细胞亚型的检测结果见图 4-A。结果显示，各组小鼠(CD3+CD8+)水平与未免疫刺激组相比均不存在显著性差异；B细胞亚型标志物(CD3-CD19+)水平，1次RRBC免疫后显著高于未免疫刺激小鼠。各组NK细胞亚型标志物水平在RRBC免疫刺激前后均不存在显著性差异。
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A、B.同图 1(same as Fig. 1) 图 4 DKO小鼠(A)和KO小鼠(B)脾脏淋巴细胞亚型分析(*p < 0.05) Figure 4 Analysis on splenic lymphocytes subtypes of DKO (A) and KO (B) mice, *p < 0.05) |
DKO小鼠脾脏淋巴细胞亚型的检测结果见图 4-B。结果显示：DKO小鼠T细胞亚型标志物(CD3+CD8+)水平在1次RRBC免疫刺激后显著高于未免疫刺激小鼠；其余各组小鼠T细胞亚型、NK细胞亚型与B细胞亚型在免疫刺激前后均不存在显著性差异。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8，这些细胞可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。在1次RRBC免疫后，小鼠CD3+CD8+升高可能是对携带外来抗原的RRBC刺激的反应。
4 讨论异种抗原中Gal抗原是动物组织、器官引起超急性免疫排斥反应的主要靶抗原，一旦进入人体，会与人体内大量的抗Gal抗体发生反应，从而导致免疫排斥反应。抗Gal-IgM抗体亚型可通过激活补体，然后与异源材料细胞结合，诱导补体介导的细胞裂解[8]；抗Gal-IgG抗体亚型通过抗体介导的细胞毒性作用，介导NK细胞，巨噬细胞与中性粒细胞，对异源材料产生细胞毒性作用[20, 21]。
6周龄的GGTA1 KO小鼠和GGTA1/iGb3S DKO小鼠在外源RRBC免疫刺激后，其抗Gal抗体水平显著升高，均表现了对外源性Gal抗原免疫刺激的敏感性。虽然已有研究显示Gal抗原的表达由GGTA1和iGb3S2个基因调控，但没有研究证明这2个基因的具体调控作用。本实验室研制的GGTA1和iGb3S双基因敲除小鼠，证实了GGTA1和iGb3S双基因敲除能够导致Gal抗原百分之百的消失。但是，本研究结果显示，GGTA1/iGb3S DKO小鼠的血清抗Gal抗体水平与GGTA1 KO小鼠相比，并没有显著的差异，而且在RRBC免疫刺激后也没有显示出更高的敏感性。2种小鼠之间在1次免疫刺激(RRBC)后血清抗-Gal IgG、抗-Gal IgM水平(吸收度值)并没有显著性差异；2次免疫刺激后血清抗-Gal IgG水平在800倍稀释，抗-Gal IgM水平在3 200倍稀释时KO小鼠组均轻度高于DKO小鼠组。由于小鼠个体间差异较大，本次研究每组的个体数(每组4只)偏少，是否有真正显著性差异尚需增加个体数后再进行统计学分析。同时，在本课题组的其他研究未发现这2种小鼠在血清抗-Gal抗体水平及对外源抗原刺激反应的不同(相关论文正在投稿中)。
Gal抗原介导的免疫排斥反应包括体液免疫和细胞免疫，是在体内存在一定水平抗-Gal抗体的情况下发生的。人体的抗Gal抗体水平显著高于Gal抗原缺失小鼠，为更好地反映人体对异种Gal抗原(如预期用于人体的动物源性生物材料中的残留Gal抗原)的免疫毒性风险，有必要对Gal抗原缺失小鼠先进行预免疫处理，提高其体内抗Gal抗体水平，使其更接近于人体特异性抗-Gal抗体滴度，这与文献报道的采用RRBC预免GGTA1 KO小鼠可以明显增强抗体滴度一致[23]。有研究报道8周龄的GGTA1 KO小鼠经RRBC(3×108个)预免疫后，其体内抗Gal-IgG抗体浓度与人体相似[23-24]。另有文献采用Gal抗原缺失(GGTA1 KO)小鼠研究猪源角膜的Gal抗原相关免疫原性，先对实验小鼠进行RRBC预免疫处理，其目的在于提高小鼠对动物源生物材料的敏感性[14]。本课题组在前期采用Gal抗原缺失(GGTA1 KO)小鼠评价牛心包中Gal抗原引起的免疫原性时发现，与不经RRBC刺激的KO小鼠相比，采用经RRBC刺激后的KO小鼠可明显提高对牛心包的敏感性(相关论文正在投稿中)。
人体内抗Gal抗体主要有IgG型和IgM型，健康人体中以抗Gal-IgG型抗体为主。GGTA1 KO小鼠随着周龄的增加，受肠道内细菌来源的Gal抗原的刺激，其体内同样表达IgG型和IgM型抗Gal抗体。根据本课题组实验室数据，人血清(AB型血液)中抗Gal-IgG抗体的含量在800倍稀释时吸收度值为1.2，而GGTA1 KO小鼠的血清在50倍稀释时吸收度值约0.35(背景值约0.2)，在RRBC免疫刺激后50倍稀释时吸收度值约1.3。对比可以得出：人血清抗Gal-IgG抗体的含量是GGTA1 KO小鼠RRBC免疫刺激前的近50倍，免疫刺激后的约16倍；人血清(AB型血液)中抗Gal-IgM抗体的含量在10倍稀释时吸收度值(0.72)，与GGTA1 KO小鼠其血清在50倍稀释时吸收度值(约0.7，背景值约0.4)相当，低于小鼠抗Gal-IgM抗体含量约5倍；GGTA1 KO小鼠在RRBC免疫刺激后升高了32倍(甚至更高)。从这些基础数据可以看到，抗Gal抗体类型分布在GGTA1 KO小鼠血清(以IgM型为主)与健康人血清(以IgG型为主)之间可能存在差异(尚需进一步验证)，GGTA1 KO小鼠总的抗Gal抗体水平远低于人体的水平。而GGTA1 KO小鼠RRBC预免疫刺激后，尽管IgM型和IgG型的分布有差异，其总抗Gal抗体水平与人体更接近，提示了GGTA1 KO小鼠RRBC预免疫刺激后应用于动物组织或者动物源性生物材料残留免疫原性评价的意义。
其他非特异性免疫学相关的功能性指标，如血清细胞因子(包括IFN-gama、IL-4与IL-12p70)与NK细胞亚型在2种基因敲除小鼠经RRBC免疫刺激前后均不存在显著性差异，说明本研究采用的预免疫方法既能提升小鼠的抗-Gal抗体水平，又不引起显著的免疫毒性反应，为后期用于动物源性生物材料残留Gal抗原的免疫排斥反应模型提供了最佳条件。
5 小结本研究采用RRBC腹腔免疫刺激2种Gal抗原缺失模式小鼠，考察免疫刺激后小鼠血清特异性抗-Gal抗体水平、其他血清炎症因子表达水平与脾脏淋巴细胞亚型的变化，综合评价2种小鼠的免疫学特性差异，分析其用于Gal抗原阳性材料免疫毒性评价的敏感性。研究结果表明，作为异种免疫原的免疫学评价模型，GGTA1 KO小鼠和GGTA/iGb3S DKO小鼠都是敏感的实验动物模型，为后期用于动物源性生物材料的免疫学评价实验动物模型的应用奠定了基础。
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