银杏叶提取物^[1]为银杏叶经加工制成的提取物，收载于《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版一部。银杏叶及其制剂中最重要的活性成分是黄酮类和银杏内酯类化合物，还有有机酸、酚、聚戊烯醇、原花青素等类化合物。《中国药典》对银杏叶提取物的两大类活性成分进行含量测定，其中，银杏内酯类化合物属于萜类化合物，因其紫外吸收较弱，以HPLC-ELSD法对萜类内酯进行含量测定。

电雾式检测器（charged aerosol detector，CAD）是一种通用型检测器^[2-3]，其检测信号不依赖于被检测物质的化学结构，其响应值不依赖于被测物质的光学性质和离子化效率，能检测大部分非挥发性或半挥发性的物质，被誉为新型通用型检测器。研究表明，与蒸发光散射检测器（ELSD）比较，CAD具有更高的检测灵敏度^[4-5]和更加均匀一致的响应因子^[6]。自2004年问世以来，CAD主要被应用于检测脂^[7]、皂苷^[2]、胆酸^[8-10]、糖及氨基糖苷^[11-12]等类具有弱紫外吸收的物质，已成功应用于中药活性成分含量测定与指纹图谱研究^[10]。

本文使用HPLC-CAD法测定银杏叶提取物中白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A和银杏内酯B 4个萜类内酯的含量，结果显示本方法可用于测定银杏叶提取物中萜类内酯的含量测定，且灵敏度优于HPLC-ELSD方法。

1 仪器和材料

Dionex Ultinate 3000高效液相色谱单元（Thermo公司），配Corona Veo RS CAD检测器（Thermo公司）；AE 240型十万分之一电子分析天平（METTLER公司）；Milli-Q超纯水处理系统（默克密理博公司）。

银杏叶提取物由浙江康恩贝制药股份有限公司、贵州信邦制药股份有限公司、贵州益佰制药股份有限公司及德国威玛舒培博士药厂提供；银杏叶总内酯对照提取物（批号610017-201501）由中国食品药品检定研究院提供；甲醇、乙腈均为色谱纯（Fisher公司），水为高纯水。

2 溶液制备 2.1 对照品溶液

取银杏叶总内酯对照提取物适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含银杏叶总内酯对照提取物2 mg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液

取银杏叶提取物样品100 mg，精密称定，置烧杯中，加磷酸盐缓冲液（pH 6.5）（取磷酸二氢钾6.25 g，磷酸氢二钠二水合物3.96 g，加水稀释至1 000 mL）7 mL，搅拌10 min，转移至Merck Extrelut NT 20硅藻土柱中，以磷酸盐缓冲液（pH 6.5）5 mL冲洗烧杯，洗液并入柱中，静置15 min使其被固定相吸附。用乙酸乙酯100 mL洗脱，收集洗脱液，60 ℃以下浓缩至干，残渣用流动相溶解并转移至5 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。

3 色谱条件

采用资生堂CAPCELL PAK MG Ⅱ C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温40 ℃，以甲醇-水（30:70）为流动相，流速1.0 mL·min^-1；以CAD检测，CAD雾化温度40 ℃；进样量10 μL。取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，色谱图见图 1。

4 方法学考察 4.1 检测下限与定量下限测定

将对照品溶液以甲醇适当稀释后制得一系列不同浓度的溶液，进样分析；S/N=3时测得白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B 4个成分的检测下限分别为14、14、28、27 ng，S/N=10时测得上述4个成分的定量下限分别为4、6、10、10 ng。

4.2 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下对照品溶液1、3、5、10、15 μL，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B的线性方程分别为：

$ \begin{array}{l} Y = - 2.378{X^2} + 17.611X + 0.940\;\;\;r = 0.9996\\ Y = - 5.967{X^2} + 23.979X + 0.301\;\;\;r = 0.9998\\ Y = - 3.473{X^2} + 24.223X + 0.741\;\;\;r = 0.9997\\ Y = - 4.077{X^2} + 30.222X + 0.228\;\;\;r = 0.9998 \end{array} $

线性范围分别为0.65~17.08、0.26~6.95、0.55~ 14.4、0.31~8.21 μg。

4.3 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样7次，测定峰面积，计算白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B峰面积的RSD分别为0.24%、0.42%、0.91%、0.64%。

4.4 重复性试验

平行称取同一批样品（德国威玛舒培，批号098）6份，按供试品溶液的制备方法处理，依法测定，并计算含量；结果白果内酯平均含量为2.92%，RSD为2.6%；银杏内酯C的平均含量为1.01%，RSD为3.0%；银杏内酯A的平均含量为1.19%，RSD为2.6%；银杏内酯B的平均含量为0.61%，RSD为3.0%。

4.5 回收率试验

取银杏叶萜类内酯对照提取物约40 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得加样回收液。精密量取加样回收液1 mL，置烧杯中，挥干溶剂，精密加入已知含量的同一批号的样品（德国威玛舒培，批号098，白果内酯含量2.92%，银杏内酯C含量为1.01%，银杏内酯A含量1.19%，银杏内酯B含量为0.61%）50 mg，按供试品溶液的制备方法，自“加磷酸盐缓冲液（pH 6.5）”起开始操作，制备供试溶液(平行制备6份），并照上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表 1~4。白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B平均回收率（n=6）分别为101.6%、95.4%、102.1%和105.1%，RSD分别为2.9%、3.0%、1.3%和2.5%。

5 样品测定

按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件进行分析，3批银杏叶提取物的测定结果见表 5。

6 讨论 6.1 银杏叶萜类内酯的测定方法

常用的检测方法有《中国药典》和美国药典采用的HPLC-ELSD^{[1, 13]}及欧洲药典采用的HPLC-IR^[14]，本实验比较了CAD与ELSD和示差折光检测器（RID）的灵敏度（表 6），结果表明CAD的灵敏度优于ELSD和RID。

6.2 流动相

《中国药典》2015年版银杏萜类内酯的含量测定方法，采用正丙醇-四氢呋喃-水为流动相，其中，四氢呋喃具有腐蚀性，正丙醇的沸点接近100 ℃，挥发性差，容易导致CAD噪音增加。故本实验改用甲醇-水为流动相，使得检测器噪音明显降低，灵敏度提高。

6.3 线性关系

本文比较了ELSD、CAD、RID对银杏叶萜类内酯的线性关系，结果表明，RID，一元线性关系较好；ELSD及CAD，二元线性及对数线性线性关系均较好。已有研究表明CAD在低浓度或浓度范围较窄的情况下，校正曲线接近线性。

6.4 响应一致性

有文献报道^[15]CAD的响应不依赖于化合物的化学结构，而与分析物颗粒的质量有关，具有较为一致的响应值，本文将各成分单位质量产生的峰面积以银杏内酯A为基准做比较，比较几种银杏叶萜类内酯类的响应一致性，并与ELSD做比较，结果见表 7，可以看出CAD与ELSD比较，响应值较为一致。