2018, Vol. 38 
2. 浙江海正药业股份有限公司, 台州 318000
2. Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Taizhou 318000, China
随着生物技术的发展，抗体-药物偶联(antibody-drug-conjugates，ADC)药物成为抗肿瘤药物研发的新方向。其作用机理是通过单克隆抗体的靶向作用特异性地识别肿瘤细胞表面抗原，然后利用细胞本身内吞作用使化学药物进入肿瘤细胞内发挥作用，杀死肿瘤细胞[1-2]。
人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor-2，HER2)是酪氨酸激酶膜受体，它在健康成年人的表皮组织低水平表达，而大约20%乳腺癌患者HER2呈现过表达[3]。曲妥珠单抗(trastuzumab)是人源化单克隆抗体，能够与HER2受体表面区域相结合，有效地治疗HER2过表达的乳腺癌和转移性胃或胃食管交界腺癌[4-5]，其作用机制主要是干扰信号传导通路，抑制DNA损伤等[6-9]。鉴于曲妥珠单抗对HER2过表达的乳腺癌疗效显著，研究者将ADC药物的理念与曲妥珠单抗相结合，研发出一种新型抗体治疗药物。
Trastuzumab emtansine(曲妥珠单抗emtansine，T-DM1)是目前国内外最新的抗乳腺癌ADC药物，其由曲妥珠单抗和细胞毒药物—美登素衍生物(DM1)组成，主要针对HER2过表达的患者。国外临床实验提示，服用T-DM1药物患者的生存率高于服用曲妥珠单抗药物患者的生存率[10]。但文献报道DM1具有一定的神经毒性[11]，因此临床前评价T-DM1药物中枢神经系统作用是至关重要的。本研究重点探讨了T-DM1药物(HS630)对中枢神经系统的影响。
1 材料和方法 1.1 实验动物40只8~9周龄SPF级Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半(雌性，246.3~261.9 g；雄性，238.1~282.0 g)，购自中国食品药品检定研究院实验动物资源中心，实验动物许可证号SCXK(京)2014-0013。PC聚碳酸酯鼠盒饲养，钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料和灭菌水，持续供给，不限量自由摄取。饲养室控制温度20~26 ℃，湿度40%~70%，换气次数每小时8~10次，12 h照明。
1.2 供试品及空白对照品供试品(注射用重组抗HER2人源化单克隆抗体偶联DM1，即HS630，批号20131101)及空白对照品(注射用重组抗HER2人源化单克隆抗体偶联DM1，批号20131102)均由浙江海正药业股份有限公司提供，2~8 ℃避光保存。
1.3 实验设计本次供试品临床拟用给药剂量为3.6 mg·kg-1，静脉注射，根据供试品特点和相关指导原则，采用单次尾静脉注射，给药体积为10 mL·kg-1，给药剂量为6、20和40 mg·kg-1。
供试品药代研究显示，SD大鼠单次给药6、20、60 mg·kg-1 HS630后，达峰时间Tmax在0.5 h或4 h，随后出现1个较慢的消除过程，浓度消除相半衰期T1/2分别为(180.1±52.8)h、(171.1±33.5)h和(133.6±32.7)h，根据该结果，本次实验设定FOB观察时间点为0.5、4、24、48、72、120及168 h。
本研究按体重随机分为4组，每组雌雄各5只，组别包括空白对照组(空白对照品)、低剂量组(6 mg·kg-1 HS630)、中剂量组(20 mg·kg-1 HS630)和高剂量组(40 mg·kg-1 HS630)。
1.4 检测指标 1.4.1 FOB实验方法本次实验采用功能观测组合实验方法(function observational battery，FOB)[12]，该方法由51个观测指标组成，包括笼内观察(12个指标)、手持观察(6个指标)、开放场观察(22个指标)、反射评价(7个指标)、肌肉力(4个指标)。
所有的操作均按照特定的顺序，对动物影响小的操作在前，动物抓取等操作在后，体温检测最后进行。FOB评分标准分为3类：第1类，该指标为能够进行严重程度分级的指标，且异常值不存在低于标准值的情况，标准值定为0N，异常情况高于标准值时，评分范围为0~4；第2类，该指标为能够进行严重程度分级的指标，且异常值存在低于标准值的情况，此时将标准值定为4N，异常情况低于标准值，评分的范围设为0~4，异常情况高于标准值，评分范围设为4~8；第3类：该指标不是对严重程度评分的指标，如死亡等，评分定为0(未发现)和1(发现)。
1.4.2 体温测定采用体温计测量大鼠体温。
1.5 统计学方法本次实验应用SPSS(13.0)统计软件进行数据分析。根据资料的性质选择相应的统计方法。其中，FOB检测指标采用非参数秩和检验，体温检测指标采用重复测量方差分析。
2 结果 2.1 笼内观察给药后4 h，HS630高剂量组(40 mg·kg-1)姿势和眼睑开合指标与空白对照组有显著统计学差异(P＜0.05)，其中观察结果显示大鼠多呈现蜷缩姿势，眼睑半关闭状态。给药后4 h，其他时间点各剂量组笼内观察各指标与空白对照组没有显著统计学差异。给药前，给药后0.5、24、48、72、120及168 h各剂量组笼内观察其他指标与空白对照组没有显著统计学差异。详见表 1。
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表 1 HS630对大鼠中枢神经系统的影响(笼内观察) Table 1 Effects of HS630 on the central nervous system of rats(in cage) |
给药前，给药后0.5、4、24、48、72、120及168 h，手持观察各指标，受试物各组大鼠未见明显异常。
2.3 开放场观察给予6 mg·kg-1受试物，动物开放场观察未见明显症状；给予20 mg·kg-1受试物，在给药后4 h，动物发现明显降低了唤醒唤起，手指接近，触摸头部，惊恐的反应，并且发现有8只动物(8/10只)出现震颤现象(与空白对照组比较P＜0.05)，随着时间点的延长可逐渐恢复，开放场其他指标未见明显异常；给予40 mg·kg-1受试物，给药后4、48、72及120 h，动物均出现不同程度唤醒唤起反应、手指接近反应、触摸头部反应、惊恐反应降低，给药后168 h上述指标均恢复，另外给药后4 h(7只/10只)和48 h(5只/10只)，出现震颤动物数明显多于空白对照组，与空白对照组有明显统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)，给药后7 d，该症状恢复，其他指标未见明显异常。详见表 2。
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表 2 HS630对大鼠中枢神经系统的影响(开放场观察) Table 2 Effects of HS630 on the central nervous system of rats(open field) |
给药前，给药后0.5、4、24、48、72、120及168 h，反射评价各指标，受试物各剂量组大鼠没有发现异常现象。
2.5 肌肉力给药前，给药后0.5、4、24、48、72、120及168 h，肌肉力各指标，受试物各剂量组大鼠没有发现异常现象。
2.6 体温研究发现，给药前，给药后0.5、4、24、48、72、120及168 h，受试物各剂量组大鼠体温与空白对照组相比, 没有统计学差异(详见图 1)。
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图 1 HS630对大鼠体温的影响 Figure 1 Effects of HS630 on body temperature of rats |
在6 mg·kg-1剂量下，HS630对大鼠中枢神经系统没有影响；在20 mg·kg-1剂量下，给药后4 h，HS630不同程度降低动物唤醒唤起反应、手指接近反应、触摸头部反应(P＜0.05)、惊恐反应，及引起动物出现明显的震颤现象(P＜0.05)，之后时间点该症状恢复。其他指标没有明显改变，与空白对照组没有统计学差异。
在40 mg·kg-1剂量下，给药后4、48、72及120 h均不同程度降低动物唤醒唤起反应、手指接近反应、触摸头部反应、惊恐反应降低，给药后7 d上述指标均恢复，以及给药后4 h和48 h，明显引起动物出现震颤现象(P＜0.05)，给药后7 d，该症状恢复。其他指标没有明显改变，与空白对照组没有统计学差异。
3 讨论美国FDA ICH7A[13]及我国《药物安全药理学研究技术指导原则》[14]均提出采用FOB方法评价药物的神经毒性。FOB主要通过行为、神经、自主体征三方面评价受试物对机体的影响。本次实验主要发现受试物20 mg·kg-1和40 mg·kg-1在给药后4 h出现唤醒唤起，手指接近，触摸头部，惊恐反应降低，以及在上述2个剂量下明显引起动物震颤，出现该现象的原因，可能与受试物中连接的小分子细胞毒药物DM1相关。文献报道表明，重复给予美登素能够使小鼠后腿致残，且降低大鼠自主活动[11]；另外临床研究也显示，DM1的使用损伤病人的中枢神经系统和外周神经系统[9]。其次，与该供试品类似的化合物，临床前结果提示给予10或30 mg·kg-1 T-DM1的猴子(1~10倍高于患者暴露范围)表现出不同程度的轴突退化[8]。上述症状出现可能与受试物偶联的DM1相关，开发者及临床使用者需密切关注ADC药物的稳定性及DM1的神经毒性。
临床前药代毒代结果显示，受试物单次给药6、20、60 mg·kg-1，Tmax为0.5 h或者4 h，本次实验结果在给药后4 h，出现中枢神经系统毒性，随着时间的延长，相关症状逐渐消失，与受试物的Tmax时间点基本吻合。
4 结论本研究结果提示，HS630在一定剂量下可能会诱发神经毒性，但是可逐渐恢复。
| [1] |
ALLEY SC, OKELEY NM, SENTER PD. Antibody-drug conjugates:targeted drug delivery for cancer[J]. Curr Opin Chem Biol, 2010, 14(4): 529. DOI:10.1016/j.cbpa.2010.06.170 |
| [2] |
LAMBERT JM. Drug-conjugated monoclonal antibodies for the treatment of cancer[J]. Curr Opin Pharmacol, 2005, 5(5): 543. DOI:10.1016/j.coph.2005.04.017 |
| [3] |
DAWOOD S, BROGLIO K, BUZDARAU, et al. Prognosis of women with metastatic breast cancer by HER2 status and trastuzumab treatment:an institutional-based review[J]. J Clin Oncol, 2010, 28(1): 92. DOI:10.1200/JCO.2008.19.9844 |
| [4] |
SPECTOR NL, BLACKWELL KL. Understanding the mechanisms behind trastuzumab therapy for human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer[J]. J Clin Oncol, 2009, 27(34): 5838. DOI:10.1200/JCO.2009.22.1507 |
| [5] |
BLACKWELL KL, BURSTEIN HJ, STORNIOLO AM, et al. Randomized study of lapatinib alone or in combination with trastuzumab in women with ErbB2-positive trastuzumab-refractory metastatic breast cancer[J]. J Clin Oncol, 2010, 28(7): 1124. DOI:10.1200/JCO.2008.21.4437 |
| [6] |
HUDIS CA. Trastuzumab-mechanism of action and use in clinical practice[J]. N Engl J Med, 2007, 357: 39. DOI:10.1056/NEJMra043186 |
| [7] |
YRDEN Y, SLIWKOWSKI MX. Untangling the ErbB signalling network[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2(2): 127. DOI:10.1038/35052073 |
| [8] |
PRESS MF, CORDON-CARDO C, SLAMON DJ. Expression of the HER-2/neu proto oncogene in normal human adult and fetal tissues[J]. Oncogene, 1990, 5(7): 953. |
| [9] |
ROSS JS, SLOSKOWSKA EA, SYMMANS WF, et al. The HER-2 receptor and breast cancer:ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine[J]. Oncologist, 2009, 14(4): 320. DOI:10.1634/theoncologist.2008-0230 |
| [10] |
POON KA, FLAGELLA K, BEYER J, et al. Preclinical safety profile of trastuzumab emtansine(T-DM1):mechanism of action of its cytotoxic component retained with improved tolerability[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2013, 273(2): 298. DOI:10.1016/j.taap.2013.09.003 |
| [11] |
REBERT CS, PRYOR GT, FRICK MS. Effects of vincristine, maytansine, and cis-platinum on behavioral and electrophysiological indices of neurotoxicity in the rat[J]. J Appl Toxicol, 1984, 4(6): 330. DOI:10.1002/(ISSN)1099-1263 |
| [12] |
MOSCARDO E, MAURIN A, DORIGATTI R, et al. An optimised methodology for the neurobehavioural assessment in rodents[J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2007, 56(2): 239. DOI:10.1016/j.vascn.2007.03.007 |
| [13] |
ICH Harmonized Tripartite Guideline: Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals S7A[S]. 2000
|
| [14] |
药物安全药理学研究技术指导原则[S]. 2014 Guidance for Safety Pharmacology Studies[S]. 2014 |