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  药物分析杂志   2018, Vol. 38 Issue (7): 1146-1151.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.07.07
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雷蓉, 赵振霞, 刘永利, 冯丽, 魏锋. 超高效液相色谱法同时测定三七的叶和花中3个皂苷类成分含量[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(7): 1146-1151. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.07.07.
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LEI Rong, ZHAO Zhen-xia, LIU Yong-li, FENG Li, WEI Feng. Simultaneous determination of three saponins in leaves and flower buds of Panax notoginseng by UPLC[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2018, 38(7): 1146-1151. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.07.07.
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基金项目

国家“重大新药创制”科技重大专项（2014ZX09304307-002）

第一作者

雷蓉, Tel:(0311)85212007-8042;E-mail:honaaa@126.com。

通信作者

冯丽, Tel:(0311)85210960;E-mail:jianyan882@163.com
魏锋, Tel:(010)67095432;E-mail:weifeng@nifdc.org.cn

文章历史

收稿日期：2017-06-09
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
超高效液相色谱法同时测定三七的叶和花中3个皂苷类成分含量
雷蓉 1, 赵振霞 1, 刘永利 1, 冯丽 1, 魏锋 2    
1. 河北省药品检验研究院, 石家庄 050011;
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
收稿日期：2017-06-09
基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项（2014ZX09304307-002）
第一作者：雷蓉, Tel:(0311)85212007-8042;E-mail:honaaa@126.com
通信作者：冯丽, Tel:(0311)85210960;E-mail:jianyan882@163.com
魏锋, Tel:(010)67095432;E-mail:weifeng@nifdc.org.cn
摘要：目的：建立超高效液相色谱法测定三七的叶和花中人参皂苷Rb1、Rb2和Rb3的含量。方法：采用Waters ACQUITY BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，流速0.4 mL·min-1，柱温30℃，检测波长203 nm。结果：人参皂苷Rb1、Rb2和Rb3线性关系良好；三七叶中上述3个成分平均加样回收率（n=9）均为100.5%，三七花中上述3个成分平均加样回收率（n=9）分别为99.3%、99.7%、98.6%。12批三七叶样品中人参皂苷Rb1、Rb2和Rb3含量范围分别为0.35%~0.59%、0.16%~0.68%、0.73%~3.33%，11批三七花样品中上述3个成分含量范围分别为0.46%~2.91%、0.83%~2.36%、2.95%~8.37%。结论：建立的方法可用于三七叶和三七花的含量测定。
关键词：三七叶、花    人参皂苷    原人参二醇型皂苷    超高效液相色谱    
Simultaneous determination of three saponins in leaves and flower buds of Panax notoginseng by UPLC
LEI Rong1, ZHAO Zhen-xia1, LIU Yong-li1, FENG Li1, WEI Feng2    
1. Hebei Institute for Drug Control, Shijiazhuang 050011, China;
2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
Abstract: Objective: To establish a method for determination of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2 and ginsenoside Rb3 in leaves and flower buds of Panax notoginseng by UPLC.Methods: The analysis was performed on a Waters ACQUITY BEH C18 column(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm), with acetonitrile(A)-water(B) as the mobile phase with gradient elution at a flow rate of 0.4 mL·min-1. The column temperature was 30and the detection wavelength was 203 nm.Results: The linear relationships of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2 and ginsenoside Rb3 were favorable; the recoveries(n=9) of the above-mentioned components in leaves of Panax notoginseng were 100.5%, 100.5% and 100.5%, respectively and the recoveries(n=9) of the above-mentioned components in flower buds of Panax notoginseng were 99.3%, 99.7% and 98.6%%, respectively. The contents of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2 and ginsenoside Rb3 in 12 batches of leaves of Panax notoginseng were 0.35%-0.59%, 0.16%-0.68% and 0.73%-3.33%, respectively. The contents of the three components in 11 batches of flower buds of Panax notoginseng samples were 0.46%-2.91%, 0.83%-2.36% and 2.95%-8.37%, respectively.Conclusion: The established method can be used for determination of leaves and flower buds of Panax notoginseng.
Key words: leaves and flower buds of Panax notoginseng    ginsenoside    protopanoxadiol saponins    UPLC    

三七(Panax notoginseng(Burk.) F. H. Chen)为五加科植物三七的根和根茎，为临床常用中药材[1]。民间常说“三七全身是宝”，随着对三七研究的深入，三七叶和三七花已作为商品流通于医药市场，对三七叶、花的化学成分、药理作用、临床应用等方面有了较多的研究报道[2-8]。三七叶与三七花主要含皂苷、黄酮、多糖等成分，两者所含的皂苷类成分极为相似，均以原人参二醇型皂苷为主。笔者结合相关文献报道[9-15]，选择分离度好，含量较高，且能体现三七叶与三七花特征的3个活性物质人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3为指标，采用超高效液相法(UPLC法)进行含量测定方法研究，为三七叶与三七花质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

Acquity超高效液相色谱仪(Waters公司，配备二元泵，PDA检测器)；AE240电子分析天平(METTLER TOLEDO公司)；超纯水仪(Millipore公司)。

对照品人参皂苷Rb1(批号110704-201424，含量以93.7%计)、人参皂苷Rb2(批号111715-201203，含量以93.8%计)、人参皂苷Rb3(批号111686-201504，含量以97.0%计)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；三七叶、三七花样品购自云南文山、广西百色三七种植基地及安徽亳州、广西玉林、湖南廉桥、湖南高桥、河北安国等药材市场；乙腈(色谱纯，Merck公司)，甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 混合对照品溶液的制备

分别精密称取人参皂苷Rb1、Rb2和Rb3的对照品适量，加80%甲醇水制成每1 mL含人参皂苷Rb1 80 μg，人参皂苷Rb2 50 μg，人参皂苷Rb3 150 μg的混合溶液，即得(含量测定时使用)。

2.2 供试品溶液的制备

取三七叶、三七花适量，粉碎，过4号筛。取三七叶粉末0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇水25 mL，称量，80 ℃水浴上保持微沸2 h，取出，放冷，再称量，用80%甲醇水补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得三七叶供试品溶液；取三七花粉末0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇水50 mL，按上述方法自“称量，80 ℃水浴上保持微沸2 h”起操作，即得三七花供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0~15 min，28% A→33%A)；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm；进样量：2 μL。在上述色谱条件下，各成分分离度良好，见图 1。

1.人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1) 2.人参皂苷Rb2(ginsenoside Rb2) 3.人参皂苷Rb3(ginsenoside Rb3) 图 1 混合对照品(A)及2号三七叶(B)、3号三七花(C)色谱图 Figure 1 Chromatograms of mixed reference substances(A), leaves of Panax notoginseng sample 2(B) and flower buds of Panax notoginseng sample 3(C)
2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察

以80%甲醇水制备系列人参皂苷Rb1对照品溶液(质量浓度依次为8.290、16.58、66.32、331.6、1 658 μg·mL-1)、人参皂苷Rb2对照品溶液(质量浓度依次为6.280、12.57、50.26、251.3、1 256μg·mL-1)、人参皂苷Rb3对照品溶液(质量浓度依次为10.29、20.59、82.34、411.7、2 058 μg·mL-1)；精密吸取上述系列对照品溶液各2 μL，分别按“2.3”项下色谱条件进样测定，以对照品进样量X(μg)为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。结果见表 1。

表 1 3个人参皂苷的线性关系考察结果 Table 1 The investigation results of linear relationship of three ginsenosides
2.4.2 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在配制后0、2、4、8、16、24 h进样测定，记录各成分峰面积积分值，计算RSD；结果人参叶中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2与人参皂苷Rb3的RSD分别为1.7%、1.5%和0.60%，三七花中上述3个成分的RSD分别为0.57%、1.8%、0.64%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验

取同一批三七叶样品粉末(过4号筛)0.3、0.6、0.9 g各3份以及同一批三七花样品粉末0.1、0.2、0.3 g各3份，按“2.2”项下方法分别制备三七叶供试溶液及三七花供试溶液；按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算含量及其RSD。结果三七叶中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rb3的含量分别为3.66、3.62与18.95 mg·g-1，RSD分别为1.6%、1.3%和0.082%；三七花中上述3个成分的含量分别为18.90、14.64和46.00 mg·g-1，RSD分别为1.5%、1.2%和0.50%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 加样回收率试验

精密称取重复性试验项下测定的已知含量的三七叶样品约0.3 g及三七花样品约0.1 g各9份，平均分为3组，分别加入用80%甲醇水溶液配制的低、中、高3个浓度的混合对照品溶液适量，按“2.2”项下方法分别制备三七叶供试溶液和三七花供试溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算回收率及其RSD，结果见表 2、3，表明该方法回收率较好。

表 2 三七叶的加样回收率试验结果 Table 2 The results of recovery experiments in leaves of Panax notoginseng

表 3 三七花的加样回收率试验结果 Table 3 The results of recovery experiments in flower buds of Panax notoginseng
2.5 样品测定

精密吸取按“2.2”项下方法制备的三七叶供试品溶液及三七花供试品溶液各2 μL进样测定，按外标法计算各样品中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rb3含量，结果见表 4、5。

表 4 三七叶含量测定结果(%) Table 4 The determination results of leaves of Panax notoginseng

表 5 三七花含量测定结果(%) Table 5 The determination results of flower buds of Panax notoginseng
3 讨论

本实验比较了40%、60%、80%甲醇水与甲醇等不同提取溶剂以及不同提取方式(超声和回流)和不同提取时间(0.5、1、1.5、2.0、2.5 h)对提取效果的影响，结果采用80%甲醇水回流提取2 h，可较好地将偏脂溶性的皂苷类成分较完全地提取出来，方法简便、易行。由于所测皂苷类成分在低波长下有末端吸收，故选择203 nm作为检测波长，选择在低波长下自身溶剂吸收干扰较小的乙腈为流动相，并采用乙腈-水溶液二元梯度洗脱，利于多成分的分离。

本研究还对三七、三七叶、三七花的化学成分进行了比较，结果三七主要含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等成分，三七叶与三七花中皂苷类成分的种类基本相同，主要含有人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3及Rc等成分，且以人参皂苷Rb3含量最高，基本不含三七皂苷R1。三七花中皂苷类成分含量约为三七叶的2~3倍。

本研究提供了一种快速、准确，重复性好、分离度高的检测方法，为三七叶、三七花的质量控制提供参考，对开发利用三七的地上部分提供技术支持。

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