2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
三七(Panax notoginseng(Burk.) F. H. Chen)为五加科植物三七的根和根茎，为临床常用中药材[1]。民间常说“三七全身是宝”，随着对三七研究的深入，三七叶和三七花已作为商品流通于医药市场，对三七叶、花的化学成分、药理作用、临床应用等方面有了较多的研究报道[2-8]。三七叶与三七花主要含皂苷、黄酮、多糖等成分，两者所含的皂苷类成分极为相似，均以原人参二醇型皂苷为主。笔者结合相关文献报道[9-15]，选择分离度好，含量较高，且能体现三七叶与三七花特征的3个活性物质人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3为指标，采用超高效液相法(UPLC法)进行含量测定方法研究，为三七叶与三七花质量控制提供科学依据。
1 仪器与试药Acquity超高效液相色谱仪(Waters公司，配备二元泵，PDA检测器)；AE240电子分析天平(METTLER TOLEDO公司)；超纯水仪(Millipore公司)。
对照品人参皂苷Rb1(批号110704-201424，含量以93.7%计)、人参皂苷Rb2(批号111715-201203，含量以93.8%计)、人参皂苷Rb3(批号111686-201504，含量以97.0%计)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；三七叶、三七花样品购自云南文山、广西百色三七种植基地及安徽亳州、广西玉林、湖南廉桥、湖南高桥、河北安国等药材市场；乙腈(色谱纯，Merck公司)，甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 混合对照品溶液的制备分别精密称取人参皂苷Rb1、Rb2和Rb3的对照品适量，加80%甲醇水制成每1 mL含人参皂苷Rb1 80 μg，人参皂苷Rb2 50 μg，人参皂苷Rb3 150 μg的混合溶液，即得(含量测定时使用)。
2.2 供试品溶液的制备取三七叶、三七花适量，粉碎，过4号筛。取三七叶粉末0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇水25 mL，称量，80 ℃水浴上保持微沸2 h，取出，放冷，再称量，用80%甲醇水补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得三七叶供试品溶液；取三七花粉末0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇水50 mL，按上述方法自“称量，80 ℃水浴上保持微沸2 h”起操作，即得三七花供试品溶液。
2.3 色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0~15 min，28% A→33%A)；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm；进样量：2 μL。在上述色谱条件下，各成分分离度良好，见图 1。
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1.人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1) 2.人参皂苷Rb2(ginsenoside Rb2) 3.人参皂苷Rb3(ginsenoside Rb3) 图 1 混合对照品(A)及2号三七叶(B)、3号三七花(C)色谱图 Figure 1 Chromatograms of mixed reference substances(A), leaves of Panax notoginseng sample 2(B) and flower buds of Panax notoginseng sample 3(C) |
以80%甲醇水制备系列人参皂苷Rb1对照品溶液(质量浓度依次为8.290、16.58、66.32、331.6、1 658 μg·mL-1)、人参皂苷Rb2对照品溶液(质量浓度依次为6.280、12.57、50.26、251.3、1 256μg·mL-1)、人参皂苷Rb3对照品溶液(质量浓度依次为10.29、20.59、82.34、411.7、2 058 μg·mL-1)；精密吸取上述系列对照品溶液各2 μL，分别按“2.3”项下色谱条件进样测定，以对照品进样量X(μg)为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。结果见表 1。
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表 1 3个人参皂苷的线性关系考察结果 Table 1 The investigation results of linear relationship of three ginsenosides |
取同一供试品溶液，分别在配制后0、2、4、8、16、24 h进样测定，记录各成分峰面积积分值，计算RSD；结果人参叶中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2与人参皂苷Rb3的RSD分别为1.7%、1.5%和0.60%，三七花中上述3个成分的RSD分别为0.57%、1.8%、0.64%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。
2.4.3 重复性试验取同一批三七叶样品粉末(过4号筛)0.3、0.6、0.9 g各3份以及同一批三七花样品粉末0.1、0.2、0.3 g各3份，按“2.2”项下方法分别制备三七叶供试溶液及三七花供试溶液；按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算含量及其RSD。结果三七叶中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rb3的含量分别为3.66、3.62与18.95 mg·g-1，RSD分别为1.6%、1.3%和0.082%；三七花中上述3个成分的含量分别为18.90、14.64和46.00 mg·g-1，RSD分别为1.5%、1.2%和0.50%，表明该方法重复性良好。
2.4.4 加样回收率试验精密称取重复性试验项下测定的已知含量的三七叶样品约0.3 g及三七花样品约0.1 g各9份，平均分为3组，分别加入用80%甲醇水溶液配制的低、中、高3个浓度的混合对照品溶液适量，按“2.2”项下方法分别制备三七叶供试溶液和三七花供试溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算回收率及其RSD，结果见表 2、3，表明该方法回收率较好。
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表 2 三七叶的加样回收率试验结果 Table 2 The results of recovery experiments in leaves of Panax notoginseng |
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表 3 三七花的加样回收率试验结果 Table 3 The results of recovery experiments in flower buds of Panax notoginseng |
精密吸取按“2.2”项下方法制备的三七叶供试品溶液及三七花供试品溶液各2 μL进样测定，按外标法计算各样品中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rb3含量，结果见表 4、5。
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表 4 三七叶含量测定结果(%) Table 4 The determination results of leaves of Panax notoginseng |
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表 5 三七花含量测定结果(%) Table 5 The determination results of flower buds of Panax notoginseng |
本实验比较了40%、60%、80%甲醇水与甲醇等不同提取溶剂以及不同提取方式(超声和回流)和不同提取时间(0.5、1、1.5、2.0、2.5 h)对提取效果的影响，结果采用80%甲醇水回流提取2 h，可较好地将偏脂溶性的皂苷类成分较完全地提取出来，方法简便、易行。由于所测皂苷类成分在低波长下有末端吸收，故选择203 nm作为检测波长，选择在低波长下自身溶剂吸收干扰较小的乙腈为流动相，并采用乙腈-水溶液二元梯度洗脱，利于多成分的分离。
本研究还对三七、三七叶、三七花的化学成分进行了比较，结果三七主要含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等成分，三七叶与三七花中皂苷类成分的种类基本相同，主要含有人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3及Rc等成分，且以人参皂苷Rb3含量最高，基本不含三七皂苷R1。三七花中皂苷类成分含量约为三七叶的2~3倍。
本研究提供了一种快速、准确，重复性好、分离度高的检测方法，为三七叶、三七花的质量控制提供参考，对开发利用三七的地上部分提供技术支持。
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