山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实，味酸，有健胃开食的功效。在中国，山楂一直被当作“药食同源”的上等补品，深受人们的喜爱，其食用和药用历史悠久，至少可以追溯到公元300年以前^[1]。山楂具有降血压，降胆固醇，降血脂和保护血管的功效^[2]。对山楂化学成分的研究，始于1921年，20世纪50年代以前的研究，多集中研究其所含的纤维素、鞣质、三萜类等成分，随着黄酮类化合物的迅速发展，发现山楂中所含的黄酮类成分对心血管系统有明显的药理作用，所以研究重点移向黄酮类成分^[3]。从山楂中分离得到60余种黄酮类化合物，其主要苷元为芹菜素(apigenin)、山柰酚类(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、槲皮素类(quercetin)及二氢黄酮类(bi-hydroflavonoids)等。黄酮类化合物具有多方面的生物活性，如儿茶素具有抗脂肪肝作用及抗癌和维生素P样作用^[4]；牡荆素具有活血化瘀，理气通脉之功效，且是防癌抗肿瘤的天然药物成分；木犀草素具有抗菌、降压和清热解毒的作用；槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性^[5-8]。

黄酮类化合物是自然界存在的一大类物质，其种类多，在植物体内大部分与不同的糖结合成苷，因此使得其更加复杂多样，不易测定，建立合理的测定方法是分析工作中的难题。常用黄酮类物质的测定方法有分光光度法^[9]、高效液相色谱法(HPLC)^[10-11]、液相色谱-质谱联用法^[12-13]。分光光度法只能测定总黄酮的含量，原理是通过颜色反应后比色定量，实际测试过程中由于杂质干扰严重，导致定量准确性差，重现性低；高效液相色谱法大多只对少数几种黄酮进行定量，且分离度要求高；有文献采用液相色谱-质谱联用研究黄酮类物质，但多数只着重于槲皮素、山柰酚、异鼠李素、儿茶素等少数几种成分的定性鉴别或结构确证^[14]。本研究对常见的、功效明确的6个黄酮，建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)同时测定该类物质的方法，测定发现山楂中含量较高的6个成分依次为金丝桃苷、槲皮素、芦丁、儿茶素、牡荆素、木犀草素，选择这6个成分作为质控指标，符合现代保健品及中成药多指标质量控制要求。该方法快速、准确、抗干扰力强，可用来监测山楂的稳定性及质量。

1 仪器与试药

Agilent 1200 LC/6410B MS液相色谱/串联四极杆质谱联用仪(Agilent公司)；Sartorious BP2HD电子天平(Sartorious公司)；HWS12型水浴锅(上海一恒科技仪器有限公司)。

对照品：儿茶素(批号110877-201203，纯度97.2%)、牡荆素(批号111687-200602，纯度100%)、木犀草素(批号111520-200504，纯度100%)、槲皮素(批号100081-200907，纯度100%)、金丝桃苷(批号1521-200202，纯度100.0%)、芦丁(批号100080-201408，纯度92.8%)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯(Merck公司)，甲酸为LC-MS级(Sigma公司)，甲醇为分析纯(广州化学试剂厂)；实验用水为二次蒸馏水；10批山楂样品产自山东、平邑、安徽、广州、广东等地，样品经广东药学院中药学院刘基柱副教授鉴定为正品，品种有山里红Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br.的干燥成熟果实和山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实，其中样品1、2、5为山里红的干燥成熟果实，样品3、4、6、7、8、9、10为山楂的干燥成熟果实。

2 方法与结果 2.1 色谱-质谱条件 2.1.1 色谱条件

采用Agilent Zorbax C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)，以乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0~4 min，15%A→60%A；4~6 min，60%A→80%A；6~7 min，80%A→15%A；7~12 min，15%A)，流速0.2 mL·min^-1，采集时间为12 min，柱温为30 ℃，进样量2 μL。

2.1.2 质谱条件

离子源为电喷雾(ESI)离子源，正离子电离模式，干燥气(N₂)温度350 ℃，干燥气(N₂)流量10 L·min^-1，雾化气(N₂)压力275.8 kPa，电喷雾电压4 000 V，扫描方式为多反应监测(MRM)模式，各成分的质谱分析参数见表 1。

2.2 对照品溶液的制备

分别取各对照品适量，用甲醇溶解制成质量浓度约500 μg·mL^-1的对照品储备液，置于冰箱保存(2个月内使用)，临用时用甲醇将上述储备液稀释成不同浓度的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取山楂样品中粉约1 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入水50 mL，摇匀，90 ℃加热回流120 min，放冷，过滤，精密量取续滤液10 mL蒸干，用甲醇复溶至5 mL量瓶中并加甲醇至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.4 基质效应的考察

采用处理后加标法考察了基质效应^[16]，以加标后测出浓度对应加入浓度计算基质效应，结果发现基质对部分黄酮成分有一定的抑制效应，但基质抑制效应均＜10%，可能是由于各物质达到充分分离以及样品是稀释了25倍之后检测，所以基质对目标物质定量影响不大，因此本方法可以不考虑基质效应对定量的影响。

2.5 线性关系考察和定量下限测定

将上述质量浓度约500 mg·L^-1的6个对照品储备液，用甲醇稀释为10、5、1、0.5、0.1、0.025、0.01、0.001 mg·L^-1的混合对照品溶液，按照上述的色谱、质谱条件，进样分析。以定量离子峰面积为纵坐标，对照品溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线；以信噪比(S/N)为10确定方法的定量下限(LOQ)。LOQ及线性回归方程等参数见表 2。

2.6 精密度试验

取中浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱、质谱条件，连续进样6次，结果儿茶素、牡荆素、槲皮素、木犀草素、芦丁、金丝桃苷峰面积的RSD分别为2.0%、1.7%、1.4%、2.0%、4.5%、0.79%，表明仪器的精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批号(150302)山楂样品6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱、质谱条件进样分析，结果儿茶素、牡荆素、木犀草素、槲皮素、芦丁、金丝桃苷的平均含量分别为5.39、0.26、0.08、14.01、5.53、54.47 μg·g^-1，RSD分别为2.9%、4.3%、3.8%、4.5%、2.5%、2.0%，表明方法的重复性良好。

2.8 稳定性试验

取混合对照品溶液，在1日内的0、4、8、12、16、20 h测定和在不同日期(3 d内的同一时间)测定，除了儿茶素只在12 h内稳定以外，其他黄酮类成分的日内RSD均小于5.0%，日间RSD均小于10%；另取处理后的供试品溶液，在1日内的0、4、8、12、16、20 h测定，6种黄酮类成分的RSD均小于10%，满足定量分析要求。

2.9 准确度试验

取山楂样品(批号150302)约0.5 g，精密称定，分别加入折算质量为本底量的80%、100%、120%的3种水平的混合对照品溶液，每个浓度平行做3份，按“2.3”项下方法制备供试溶液，进行加样回收试验，取3次操作的平均值，6个黄酮成分在3种不同添加浓度下的回收率都在80.4%~105.0%之间，RSD＜10%(表 3)。

2.10 含量测定

采用该方法检测了10批山楂，检测数据见表 4。结果显示10批山楂的6个黄酮类成分的含量有较大波动，说明该10批山楂产地不同，质量有一定的差异性。

3 讨论 3.1 黄酮成分的确定

本文参照文献[15]的方法筛查了山楂中的儿茶素、牡荆素、葛根素、大豆苷元、水飞蓟宾、槲皮素、木犀草素、芹菜素、柚皮素、橙皮素二氢查尔酮、山柰酚、橙皮素、异鼠李素、黄芩素、川陈皮素、桔皮素16个黄酮的含量，由测定结果发现山楂中含量较高的6个成分依次为金丝桃苷、槲皮素、芦丁、儿茶素、牡荆素、木犀草素，而其他成分含量低于检测下限，无法检测，因此建立了液相色谱-串联质谱法同时测定山楂中6个含量较大的黄酮类物质。

3.2 色谱条件的优化

分别试用了不同型号的色谱柱[Thermo C₈(150 mm×2.1 mm，2 μm)、Thermo C₁₈(150 mm×2.1 mm，2 μm)和Agilent Zorbax C₁₈(100 mm×2.1 mm，2 μm)]，结果显示：Agilent Zorbax C₁₈色谱柱对于各种物质的分离效果比较理想。对比了A、B、C 3种流动相体系[A：乙腈-0.1%(v/v，下同)甲酸水溶液；B：乙腈-0.1%甲酸水溶液(含甲酸铵10 mmol·L^-1)；C：甲醇-0.1%甲酸水溶液(含甲酸铵10 mmol·L^-1)]，结果表明使用A体系，各物质灵敏度高，检测下限低；使用B体系时，异构体木犀草素和槲皮素分离度不够；使用C体系作流动相时，槲皮素的定量下限只能达到0.3 μg·mL^-1。综合以上因素，得到最佳色谱条件：采用Agilent Zorbax C₁₈色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱。在此条件下检测得到6个黄酮的MRM图见图 1。

3.3 质谱条件的优化

黄酮类化合物主要是基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物，母核上有-OH、-OCH₃等不同取代基，而且结构中具有碱性氧原子，因此选用ESI⁺作为离子化模式，6种黄酮均易得到一个质子形成[M+H]⁺准分子离子峰，作为母离子。分别对母离子进行碰撞诱导解离，以获得2次碎裂产生的子离子。分别选择离子丰度高、基线噪声低的2对离子对作为定性离子对，选择离子丰度最高的离子对作为定量离子对；在此基础上逐个优化了对灵敏度影响较大的碰撞能量和源内碎裂电压，使选定的子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳。最后得到优化后的参数见表 1，总离子流图见图 2。