黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连C. deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云连C. teeta Wall.的干燥根茎，以上3种分别习称“味连”、“雅连”、“云连”^[1]。黄连具有清热燥湿、泻火解毒的功效，用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、心悸不宁、血热吐衄、目赤、牙痛、消渴、痈肿疔疮。因目前味连在临床上使用较为广泛，且产量大，因此选取味连饮片作为本文研究对象。味连的主要活性成分为异喹啉类生物碱化合物，且结构相似，其中小檗碱(berberine)含量最高，此外还含有药根碱(jatrorrhizine)、非洲防己碱(columbamine)、表小檗碱(epiberberine)、黄连碱(coptisine)、巴马汀(palmatine)和木兰花碱(magnoflorine)等生物碱^[2]。黄连因其4个生物碱(小檗碱，表小檗碱，黄连碱，巴马汀)具有良好的广谱抗菌作用而受到关注，目前对于黄连有效成分含量测定以及质量评价均以这4个成分作为指标^[3]。但现代研究表明，黄连中其他生物碱类成分也有不同的药理作用，如药根碱具有抑制单胺氧化酶活性的作用^[4]，而非洲防己碱、木兰花碱等具有降血压、降血脂、降血糖的作用^[5]。为此，笔者将一测多评法运用到黄连生物碱类成分的测定中，采用1个对照品实现对味连6个有效成分非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的同步测定，以全面控制味连药材及其饮片的质量。

1 仪器与试药

安捷伦公司Agilent 1200 HPLC系统(自动脱气机、四元泵、自动进样器、检测器、化学工作站)。上海科导超声仪器有限公司SK7200HP超声清洗器，METTLER TOLEDO公司XSE105DU十万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司AL204万分之一电子天平。

味连药材：2批采自重庆市石柱县黄水镇，1批采自湖北省利川市忠路镇，1批采自湖北省利川市建南镇，由湖北中医药大学鉴定教研室张秀桥教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎，即味连。

对照品非洲防己碱(批号W30M7Z15501)、药根碱(批号Y1003S1)、黄连碱(批号Z24F4B1)、表小檗碱(批号H25F3X1)、巴马汀(批号ZM0520XA14)、小檗碱(批号Y11A6W1)均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均＞98%；乙腈为色谱纯，水为双重蒸馏水，三乙胺、磷酸等试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Agilent Extend C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以水(含0.3%磷酸及0.2%三乙胺)为流动相A，乙腈为流动相B，线性梯度洗脱(0~10 min，80%A；10~40 min，80%A→45%A；40~60 min；45%A→10%A)，流速0.7 mL·min^-1，柱温20 ℃，检测波长268 nm，进样量20 μL。在上述色谱条件下，非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱色谱峰分离度良好，经Agilent紫外-可见分光检测器检测，所有目标色谱峰纯度角均小于纯度阈值，表明各色谱峰无杂质干扰，方法专属性强。见图 1。

2.2 味连不同饮片的制备^[6] 2.2.1 味连饮片

取味连药材，除去杂质，抢水洗净，润透后切薄片，干燥，筛去碎屑，即得。

2.2.2 姜味连饮片

取净味连饮片，加姜汁(每100 kg味连，用生姜12.5 kg)拌匀，闷润，待姜汁被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热炒干，取出、晾凉，筛去碎屑。

2.2.3 萸味连饮片

取净味连饮片，加吴茱萸煎汁(每100 kg味连，用吴茱萸10 kg)拌匀，闷润，待吴茱萸汁被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热炒干，取出、晾凉，筛去碎屑。

2.3 溶液的制备 2.3.1 供试品溶液

取味连不同饮片粉末(过2号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100：1)50 mL，密塞，称量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 单一对照品溶液及混合对照品溶液

取非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的对照品适量，精密称定，加甲醇配制成质量浓度分别为0.103、0.059、0.095、0.136、0.099、0.49 mg·mL^-1的单一对照品溶液；依次精密吸取上述6个单一对照品溶液各1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.3.2”项下各单一对照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入高效液相色谱仪，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表 1。

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，计算出6个生物碱成分峰面积的RSD为0.11%~0.15%。

2.6 稳定性试验

按上述色谱条件，取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h注入高效液相色谱仪，依法测定，记录峰面积，得6个生物碱类成分峰面积的RSD为0.14%~0.18%。表明处理后的样品在1 d内稳定。

2.7 重复性试验

称取同一批味连饮片样品粉末约0.2 g，共6份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样测定，测得非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的平均含量分别为1.26%、0.88%、1.02%、2.43%、1.93%、8.92%，其RSD为0.26%~0.67%，表明方法重复性良好。

2.8 回收率试验

取同一批已知含量的样品约0.1 g，共6份，精密称定，按照与所取样品中待测定成分量之比控制在1：1左右浓度水平精密加入对应的对照品，按“2.3.1”项下方法制备供试溶液，在上述色谱条件下进样测定，计算加样回收率，结果见表 2。

2.9 校正因子计算

取“2.3.2”项下混合对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，以小檗碱为内标，按公式f=A_s×C_i/(A_i×C_s)(式中C_i为内标物浓度，A_i为内标物峰面积，C_s为组分s浓度，A_s为组分s峰面积)计算非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀的相对校正因子分别为1.351、1.094、1.304、1.361、1.451。

2.10 校正因子的重现性考察 2.10.1 色谱柱考察

精密吸取“2.3.2”项下混合对照品溶液10 μL，按上述色谱条件，在Agilent 1200高效液相色谱仪上考察Agilent Extend C₁₈(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsil C₁₈(250 mm×4.6 mm，5 μm) 2种色谱柱，结果采用不同的色谱柱所得到的校正因子基本一致，表明校正因子重现性良好。

2.10.2 进样量考察

取“2.3.2”项下混合对照品溶液，分别进样不同体积，测定峰面积，计算小檗碱与非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱和巴马汀的相对校正因子分别为1.351、1.094、1.304、1.361、1.451，RSD分别为0.24%、0.63%、0.49%、0.19%、0.23%，表明在不同进样量下，小檗碱与各成分之间的相对校正因子的重现性良好。

2.11 待测成分的色谱峰定位

色谱峰的准确定位是保证一测多评法应用的前提，参照色谱定位方法，以相对保留时间(待测成分与内标成分保留时间之比)作为定位标准，并在不同品牌色谱柱下对此参数进行考察，各成分的相对保留时间波动较小，表明可将此参数用于目标峰的定位。

2.12 样品测定

分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液及小檗碱对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，依法测定。首先按照建立的QAMS法进行生物碱类成分色谱峰的定位，并对其含量进行实际测算，再以外标法进行测定，以验证QAMS法的合理性。试验结果表明，相对保留时间定位方法可行，采用一测多评法与外标一点法所测得的黄连中6个生物碱类成分的含量基本一致，相对误差(RE)＜5%，说明本方法在味连生物碱成分检测中的适用性良好。结果见表 3。

3 讨论 3.1 不同检测波长对图谱的影响

黄连的HPLC指纹图谱的检测器多为紫外检测器，紫外检测图谱的特征峰较多，信号强，能较好地反映黄连饮片的整体特征。乐巍等^[7]建立了雅连的指纹图谱，所用条件为磷酸缓冲盐溶液与乙腈梯度洗脱，检测波长230 nm，参比波长360 nm，结果共分离检测得到8个共有峰。黄小平等^[8]以乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH为3.0)为流动相，梯度洗脱，检测波长为270 nm。杨林^[9]采用流动相乙腈-50 mmol·L^-1磷酸二氢钾溶液(40：60)，检测波长268 nm，确定了11个共有峰，并对其中6个色谱峰进行了指认，分别为小檗碱、巴马汀、黄连碱、药根碱、非洲防己碱、格兰地新(groendicine)。故选择紫外检测器，比较了不同检测波长(268、230、270 nm)的图谱。结果表明，采用268 nm检测，色谱峰形好，基线平稳，各成分分离度好。

3.2 流动相和流动相比例的选择

使用高效液相色谱对黄连中生物碱类成分进行分析时，多采用乙腈和一定浓度十二烷基硫酸钠的磷酸水溶液作为流动相，进行等度洗脱^[10]。但由于黄连中所含成分复杂，保留时间长且分离度较差，流动相中含有十二烷基硫酸钠不便采用梯度洗脱，故本文选用乙腈和磷酸三乙胺水溶液进行梯度洗脱的方式。

3.3 黄连多种成分测定研究现状

文献调研发现，已有测定黄连中5个生物碱含量的报道^[11]，但这些文献所报道的方法不易在实际工作中应用，因要获得每一种对照品较困难，尤其是表小檗碱(纯化难度极大)和黄连碱，直接限制了用常规的外标或内标法来实现其多指标质量控制的设想。卿大双等^[12]提出建立一测多评法对黄连进行质量控制，但其所用流动相呈弱碱性，对色谱柱损耗较大。