2018, Vol. 38 
当归芍药散出自汉代张仲景所著的《金匮要略》，原文记载“妇人怀妊，腹中绞痛，当归芍药散主之；妇人腹中诸疾痛，当归芍药散主之”[1]。该方由当归、芍药、川芎、泽泻、茯苓、白术6味药材组成，具有补血活血，养血敛阴，调经止痛，燥湿利水等功效。现代药理学研究表明，当归芍药散不但可以应用于妇科疾病，如痛经、闭经、不育等的治疗[2-3]，还对以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统疾病，如阿尔茨海默病具有一定的治疗作用[4]，具有较好的临床应用前景。
当归芍药散中当归、芍药和川芎对全方效应影响较为显著，白术、泽泻、茯苓起良好的辅助作用[5]。其中，芍药苷和芍药内酯苷为芍药中的代表性单萜苷类成分，具有镇痛，解痉，抗炎和促进肌肉松弛等作用[6-7]；阿魏酸为当归和川芎中的代表性有机酸类成分，具有抗血栓形成，抗氧化，抗炎和促进肌肉松弛等作用[8-9]；24-乙酰泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇B为泽泻中的代表性三萜类成分，具有降糖和抗炎作用[10]；白术内酯Ⅰ为白术中的代表性内酯类成分，具有调节胃肠道以及促进营养物质吸收的功能[11-12]。目前，文献主要采用常规高效液相色谱法[13-15]对当归芍药散中的活性成分进行定量分析，存在专属性差，分析时间较长，检测指标少，样品处理复杂等缺点。近年来，超快速液相色谱(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)技术由于在峰容量、分析效率、灵敏度和分辨率方面均优于常规HPLC，并可在极短的时间内达到柱平衡或重新平衡，显著减少分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本，已越来越多地应用于中药复方的质量控制研究[16-17]。为了更有效地控制该制剂的质量，本研究建立了测定当归芍药散中芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ含量的超快速液相色谱法(UFLC法)，所建立的分析方法分析时间明显缩短，分析效率显著提高，可用于当归芍药散的质量控制研究。
1 仪器与试药 1.1 仪器岛津公司Prominence UFLC型超高快速液相色谱仪(配备Prominence SIL-20AHT自动进样器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器，LC solution色谱工作站)；昆山市超声仪器有限公司KQ-250DE型数控声波清洗器；赛多利斯仪器有限公司CPA 225D型电子天平；天津泰斯特仪器有限公司FW80型微型高速万能试样粉碎机。
1.2 试药芍药苷对照品(批号110736-201640)、阿魏酸对照品(批号110773-201614)、23-乙酰泽泻醇B对照品(批号111846-201504)和白术内酯Ⅰ对照品(批号111975-201501)购自中国食品药品检定研究院，芍药内酯苷对照品(批号151109)和24-乙酰泽泻醇A对照品(批号140615)购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98%。乙腈和甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。当归、芍药、川芎、泽泻、茯苓和白术药材购自吉林市吉林大药房，产地分别为甘肃、安徽、安徽、福建、四川和浙江，经吉林医药学院生药教研室李景华副教授鉴定，当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根，芍药为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora PALL.的干燥根，川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientale(Sam.) Juzep.的干燥块茎，茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，样本留存于吉林医药学院药学院中药样品室。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品储备液分别精密称取芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ的对照品适量，置于5 mL量瓶中，用甲醇配制成质量浓度分别为1.0、1.0、0.1、1.0、1.0和0.1 mg·mL-1的单一成分对照品储备液，置于4 ℃冰箱内保存备用。由于阿魏酸、白术内酯Ⅰ不稳定，见光容易分解，需采用棕色量瓶配制并避光保存。
2.1.2 供试品溶液参照《金匮要略》原文，折合成现代剂量，分别称取当归9 g、白芍30 g、川芎15 g、泽泻12 g、茯苓12 g、白术15 g，置于粉碎机中粉碎成细粉，过80目筛，混匀，即得当归芍药散。精密称取当归芍药散粉末0.2 g，置100 mL圆底烧瓶中，加入70%甲醇20 mL，称量，加热回流30 min，放冷，再称量，用70%甲醇补足减失的量，摇匀，取上清液离心(4 000 r·min-1)5 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.1.3 阴性样品溶液按处方量分别制备不含当归和川芎的阴性样品、不含芍药的阴性样品、不含泽泻的阴性样品和不含白术的阴性样品，按“2.1.2”项方法操作，即得。
2.2 色谱条件采用岛津公司Shim-Pack XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)，预柱为岛津公司C18保护柱(4 mm×3.0 mm，2.2 μm)，流动相为0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，测定芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B时采用梯度洗脱(0~10 min，14%B；10~11 min，14%B→80%B，11~20 min，80%B)，平衡时间为2 min，测定白术内酯Ⅰ时采用等度洗脱(0~6 min，38%B)，流速0.4 mL·min-1，柱温为35 ℃，检测波长为232 nm(芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、白术内酯Ⅰ)和208 nm(24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B)，进样量为5 μL。色谱图见图 1和图 2。
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1.芍药内酯苷(albiflorin) 2.芍药苷(paeoniflorin) 3.阿魏酸(ferulic acid) 4. 24-乙酰泽泻醇(24-acetyl alisol A) 5. 23-乙酰泽泻醇B(23-acetyl alisol B) 图 1 混合对照品232 nm(A)、混合对照品208 nm(B)、样品232 nm(C)、样品208 nm(D)、不含当归和川芎的阴性样品232 nm(E)、不含芍药的阴性样品232 nm(F)、不含泽泻的阴性样品208 nm(G)的UFLC色谱图 Figure 1 UFLC chromatograms at mixed reference substances at 232 nm(A), mixed reference substances at 208 nm(B), sample at 232 nm(C), sample at 208 nm(D), negative sample without Angelicae Sinensis Radix and Chuanxiong Rhizoma(E), negative sample without Paeoniae Radix Alba(F), and negative sample without Alismatis Rhizoma(G) |
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1.白术内酯Ⅰ(atractylenolide Ⅰ) 图 2 白术内酯Ⅰ对照品(A)、样品(B)、不含白术的阴性样品(C)的UFLC色谱图 Figure 2 UFLC chromatograms of atractylenolide Ⅰ(A), sample(B) and negative sample without Atractylodis Macrocephalae Rhizoma(C) |
分别精密吸取“2.1.1”项下芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B的对照品储备液适量，置于同一5 mL量瓶中，用甲醇-水(70：30)配制成含芍药苷质量浓度分别为10、20、50、100、200和500 μg·mL-1，芍药内酯苷质量浓度分别为2、4、10、20、40和100 μg·mL-1，阿魏酸质量浓度分别为0.2、0.4、1.0、2.0、4.0和10 μg·mL-1，24-乙酰泽泻醇A质量浓度分别为2、4、10、20、40和100 μg·mL-1，23-乙酰泽泻醇B质量浓度分别为2、4、10、20、40和100 μg·mL-1的系列混合对照品溶液；按照相同方法精密吸取“2.1.1”项下白术内酯Ⅰ对照品储备液适量，用甲醇-水(70：30)配制含白术内酯Ⅰ质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg·mL-1的系列对照品溶液。分别精密吸取上述系列溶液进样5 μL，进样测定色谱峰面积；以对照品质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，色谱峰峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归，芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ的回归方程分别为：
| $ \begin{array}{l} \mathit{Y}{\rm{ = 1}}{\rm{.996}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{4}}}\mathit{X}{\rm{ + 2}}{\rm{.765}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{4}}}\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.999}}\;{\rm{9 }}\\ \mathit{Y}{\rm{ = 1}}{\rm{.793}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{4}}}\mathit{X}{\rm{ + 7}}{\rm{.224}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{2}}}\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.999}}\;{\rm{9 }}\\ \mathit{Y}{\rm{ = 4}}{\rm{.226}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{4}}}\mathit{X}{\rm{ - 4}}{\rm{.915}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{2}}}\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.999}}\;{\rm{9 }}\\ \mathit{Y}{\rm{ = 9}}{\rm{.838}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{3}}}\mathit{X}{\rm{ + 2}}{\rm{.319}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{3}}}\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.999}}\;{\rm{7 }}\\ \mathit{Y}{\rm{ = 1}}{\rm{.285}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{4}}}\mathit{X}{\rm{ + 3}}{\rm{.082}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{4}}}\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.999}}\;{\rm{3 }}\\ \mathit{Y}{\rm{ = 4}}{\rm{.718}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{4}}}\mathit{X}{\rm{ - 4}}{\rm{.285}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{3}}}\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.999}}\;{\rm{8 }} \end{array} $ |
结果表明，芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ质量浓度分别在10~500、2~100、0.2~10、2~100、2~100和0.1~5 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验精密吸取“2.3”项下制备的芍药苷质量浓度为100 μg·mL-1，芍药内酯苷质量浓度为20 μg·mL-1，阿魏酸质量浓度为2 μg·mL-1，24-乙酰泽泻醇A质量浓度为20 μg·mL-1，23-乙酰泽泻醇B质量浓度为20 μg·mL-1的混合对照品溶液以及白术内酯Ⅰ质量浓度为1 μg·mL-1的对照品溶液各200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上。按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯峰面积的RSD(n=6)分别为1.1%、0.62%、1.6%、2.1%、2.3%和2.6 %，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验取同一批次的供试品溶液，放置于室温，分别于0、2、4、8、12和24 h进样测定，记录峰面积。结果芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ峰面积的RSD分别为1.7%、2.6%、1.7%、1.6%、1.0%和2.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.6 重复性试验取同一批次当归芍药散样品6份，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样5 μL，记录峰面积，计算含量。结果芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ的含量平均值(n=6)分别为0.94%、0.21%、0.043%、0.043%、0.022%和0.0028%，RSD分别为2.2%、2.1%、2.3%、2.5%、2.9%和2.4 %，表明方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验精密称取已知含量(芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ的含量分别为0.94%、0.21%、0.043%、0.043%、0.022%和0.002 8%)的当归芍药散样品粉末9份，每份0.1 g，精密称定，分别加入相当于样品中芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ含有量的80%，100%，120%的对照品溶液适量，各3份。按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，进样5 μL测定，计算芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ的回收率和RSD，结果见表 1。
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表 1 当归芍药散样品中芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ的回收率 Table 1 Recoveries of paeoniflorin, albiflorin, ferulic acid, 24-acetyl alisol A, 23-acetyl alisol B and atractylenolide Ⅰ |
精密称取6批当归芍药散样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样5 μL，每批溶液平行进样3次，通过标准曲线回归方程计算芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ的含量。6批样品测定结果见表 2。
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表 2 当归芍药散样品中芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ的含量(n=6) Table 2 The contents of paeoniflorin, albiflorin, ferulic acid, 24-acetyl alisol A, 23-acetyl alisol B and atractylenolide Ⅰ in Danggui Shaoyao San |
《中华人民共和国药典》2015年版中使用稀乙醇作为提取溶剂并采用超声提取法测定芍药中芍药苷的含量，使用70%甲醇作为提取溶剂并采用回流提取法测定当归和川芎中阿魏酸的含量，使用乙腈作为提取溶剂并采用超声提取法测定泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量，未建立白术药材的含量测定方法。本研究对比了回流提取法和超声提取法对当归芍药散中6个活性成分的提取效率。结果显示，加热回流法提取30 min所得供试品溶液中6个活性成分的综合提取效率明显高于超声提取法。同时对比了50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液以及50%、70%、100%乙腈溶液回流提取对当归芍药散中6个活性成分的提取率，结果显示，70%甲醇提取的综合提取效率最高。
3.2 流动相的选择分别考察了甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%甲酸水4种流动相体系。结果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液流动相体系分离效果最佳。其中，芍药苷、芍药内酯苷和阿魏酸在乙腈-0.1%磷酸水(14：86)条件下能够较好地分离，24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B在乙腈-0.1%磷酸水(80：20)条件下能够较好地分离，白术内酯Ⅰ在乙腈-0.1%磷酸水(38：62)条件下能够较好地分离。但使用UFLC同时测定6个活性成分时，由于白术内酯Ⅰ含量较低，容易受其他成分干扰而无法成功分离，因此本研究采用乙腈-0.1%磷酸水作为流动相进行梯度洗脱(0~10 min，14%乙腈；10~11 min，14%乙腈→80%乙腈；11~20 min，80%乙腈)，测定当归芍药散中芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B的含量，采用乙腈-0.1 %磷酸水(38：62)作为流动相等度洗脱，测定白术内酯Ⅰ的含量，在保证药材中被测活性成分充分洗脱且其他未知成分不干扰样品测定的同时，大大缩短了分析时间。
3.3 检测波长的选择采用DAD检测器对6个活性成分进行光谱扫描，结果显示，芍药苷和芍药内酯苷在232 nm处有最大吸收，阿魏酸在235 nm和322 nm处有最大吸收，因此，采用232 nm作为芍药苷、芍药内酯苷和阿魏酸的检测波长；24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B在208 nm处有最大吸收，在232 nm处无吸收峰，因此，采用208 nm作为24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B的检测波长；白术内酯Ⅰ在232 nm和220 nm有最大吸收，但232 nm处分离效果明显优于220 nm，因此采用232 nm作为白术内酯Ⅰ的检测波长。
3.4 小结本研究建立了测定当归芍药散中芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B和白术内酯Ⅰ的UFLC分析方法，并应用该方法检测了6批当归芍药散中上述6个活性成分的含量。结果表明，本研究建立的UFLC方法分析时间短，稳定性好，专属性强，准确度高，可为当归芍药散质量控制和进一步体内研究提供参考。
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