牛黄在我国已有2 000多年的药用历史，始载于《神农本草经》，为牛科动物牛Bos taurus domesticus Gmelin的干燥胆结石^[1]。其味苦，性凉，治热病神昏、谵语，癫痫发狂，小儿惊风抽搐，牙疳，喉肿，口舌生疮，痈疽，疔毒。现代研究已证实牛黄具有解热、镇痛、止咳、祛痰、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等诸多药理作用。同时，牛黄还可与其他中药配伍组成多种复方制剂，广泛用于中枢神经、心血管、呼吸等系统相关疾病的治疗^[2-6]。

牛黄稀少难得，资源匮乏，不仅价格昂贵，且难以满足临床用药的需求。因此，许多国内外学者长期以来致力于寻找牛黄的代用品。1972年，国家药品监督管理部门陆续批准了3种牛黄代用品，即人工牛黄、培植牛黄和体外培育牛黄。其中牛黄、人工牛黄、体外培育牛黄的标准收载于《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015年版一部，培植牛黄则收载于《新药转正标准》第七册^[7]。为了更好地满足牛黄的临床应用需求，本文就牛黄及其代用品的化学成分、分析方法以及药理作用等进行系统综述。

1 化学成分 1.1 牛黄

牛黄(Bovis Calculus)又名西黄、犀黄、丑宝，习称“天然牛黄”。其生于牛的胆囊或胆管，属于病理产物。20世纪初以来^[8]，经过国内外众多学者的研究，牛黄所含的化学成分已基本清楚，主要包括胆汁色素(胆红素和胆绿素)、胆汁酸、胆甾醇、脂肪酸、卵磷脂、粘蛋白、平滑肌收缩物质、氨基酸、类胡萝卜素、油状强心类成分、无机成分及维生素D等。其中，胆红素包括游离胆红素和结合胆红素，胆汁酸包括游离胆汁酸(胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸和石胆酸等)和结合胆汁酸(甘氨胆酸、牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸和牛磺去氧胆酸等)。

1.2 人工牛黄

人工牛黄是由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇和微量元素等加工制成^[1]。1956年天津制药厂首次成功研制“人工合成牛黄”，北京同仁堂提炼厂也相继进行了生产^[9]。人工牛黄现用方是含胆红素0.7%，去氧胆酸15%，猪胆酸15%，牛羊胆酸12.5%，胆固醇2%，无机盐5%以及多量淀粉的混合物^[10]。

1.3 体外培育牛黄

体外培育牛黄是以牛科动物牛Bos taurus domesticus Gmelin的新鲜胆汁为母液，加入去氧胆酸、胆酸、复合胆红素钙等制成^[1]。其主要化学成分为胆色素、胆酸、胆固醇、磷脂、肽类、氨基酸以及微量元素等。其中，胆色素类化合物含量为72%~76%，胆红素含量占其中的25%~70%；胆酸类化合物，含胆酸7%~10%，去氧胆酸0.45%，另外还含有少量的牛磺酸胆酸盐、甘氨酸胆酸盐等；脂类化合物，其中含胆固醇2.5%~4.8%，卵磷脂0.17%~0.20%；氨基酸类，总氨基酸含量为6 159.9 μg·g^-1，其中牛磺酸占游离氨基酸总量的15.86%，苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸等占其总量的20.25%；还含钙(Ca)、钠(Na)、铁(Fe)、钾(K)、铜(Cu)、镁(Mg)、磷(P)等微量元素^[11]。另外，酶促牛黄是一种体外培育牛黄，尚处于实验室研究阶段，但初步研究显示，酶促牛黄在许多方面接近牛黄^[12]。

1.4 培植牛黄

人工培植牛黄是利用活牛体，以外科手术的方法在牛的胆囊内插入致黄因子，使之生成牛黄。早在20世纪70年代，林如忠^[13]就已开展了牛体内育黄的研究，并成功获得了培植牛黄。培植牛黄因受生产单位手术技术的影响，化学成分也有所差异。其胆红素含量趋近于牛黄，胆酸含量则一般略高于牛黄^[14]。培植牛黄与牛黄所含的某些微量元素及氨基酸含量相近，但钙含量低于牛黄，总氨基酸及大部分氨基酸含量均高于牛黄^[15]。

2 分析方法 2.1 定性分析

市场上牛黄及其代用品质量参差不齐，定性分析能够识别真伪，判断优劣，为临床使用牛黄及其代用品提供质量保障。牛黄、培植牛黄、体外培育牛黄的定性分析方法基本相同，但与人工牛黄差异较大。

2.1.1 性状鉴别

牛黄、培植牛黄及体外培育牛黄呈球形或类球形，表面光滑，呈棕黄色。体轻，质松脆，断面有同心层纹气香，味苦而后甘，有清凉感，嚼之易碎，不粘牙。在检测过程中，一般取粉末少量，用清水调和，涂于指甲上，三者均能将指甲染成黄色。

人工牛黄多为疏松粉末，也有制成不规则球形或方形的产品。其多呈浅棕黄色或金黄色，质轻、松，水溶液亦能将指甲染成黄色。人工牛黄与牛黄、培植牛黄及体外培育牛黄之间的明显区别在于，人工牛黄气微清香而略腥，味微甜而苦，入口后无清凉感。

2.1.2 显微鉴别

牛黄、培植牛黄和体外培育牛黄：取粉末少许，用水合氯醛试液装片，不加热，置显微镜下观察：其不规则团块由多数黄棕色或棕红色小颗粒集成，稍放置，色素迅速溶解，并显鲜明金黄色，久置后变绿色。

人工牛黄：取少量粉末，以50%甘油酒精溶液装片。置显微镜下观察，可见大量的淀粉粒，均为单粒，少有复粒。有红棕色的团块状物(为胆汁的凝固物)，表面可见细小的颗粒状凸起。还有开裂状的不规则形碎块，形似石细胞，但无层纹。另有不规则多面体晶块，棱角明显(胆酸盐结晶)^[16]。

2.1.3 理化鉴别^[17-18]

牛黄、培植牛黄、体外培育牛黄的理化鉴别方法一般有三氯甲烷、醋酸和冰醋酸色环等试验。

三氯甲烷试验(检查胆红素)：取粉末少量，加三氯甲烷1 mL，摇匀后加硫酸与30%过氧化氢溶液各2滴，振摇，即显绿色。

醋酸试验(检查胆酸)：取粉末0.1 g，加60%醋酸4 mL，研磨，滤过。取滤液1 mL，加新制的糖醛(加蒸馏水至几乎无色)溶液(1：100)1 mL与硫酸溶液(硫酸50 mL，蒸馏水65 mL混合)10 mL，置70 ℃水浴加热10 min，即显蓝紫色。

冰醋酸色环试验(检查甾醇)：取粉末少许，加冰醋酸显绿色，待冷透后，小心加入等量的硫酸溶液，结果下层无色，上层呈绿色，两层相接处呈现红色环。

2.1.4 薄层色谱

当前，多应用薄层色谱法分析牛黄、培植牛黄和体外培育牛黄是否含有胆酸和去氧胆酸，2015年版《中国药典》分析人工牛黄是否含有胆酸和猪去氧胆酸。以胆酸、(猪)去氧胆酸为对照品，展开，取出，晾干，喷洒显色剂，加热显色，置紫外灯(365 nm)下检视，在与对照品色谱相应的位置上，样品显相同颜色的荧光斑点。

对于胆红素的薄层色谱定性分析，牛黄以胆红素为对照品，展开，取出，晾干，在与对照品色谱相应的位置上，样品显相同颜色的斑点。人工牛黄则应用紫外分光光度法进行测定，在650 nm波长处有最大吸收。体外培育牛黄和培植牛黄根据胆红素化学性质加氯仿进行理化定性分析。

对比《中国药典》中牛黄、体外培育牛黄、人工牛黄和培植牛黄的定性方法，只有人工牛黄中存在牛磺酸的定性分析。以牛磺酸为对照品，展开，取出，晾干，在105 ℃加热10 min，喷以1%茚三酮乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。样品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.1.5 近红外光谱^[19]

利用主成分分析法观察牛黄和人工牛黄主成分的空间分布，并采用判别分析法建立定性鉴别模型，利用显微近红外光谱技术可以有效提取牛黄药材中的多种信息，能够达到快速、无损、整体分析鉴别人工牛黄和天然牛黄的目的。

2.2 定量分析 2.2.1 胆红素

2015年版《中国药典》一部中应用紫外分光光度法对人工牛黄和体外培育牛黄中的胆红素进行含量测定。

除上述《中国药典》收载的方法，依据胆红素的相关性质，还有以下几种常见的牛黄及其代用品中胆红素含量测定方法。

2.2.1.1 水溶剂法^[20]

以二甲基亚砜为溶解胆红素的溶剂，水为稀释剂，苯甲酸钠咖啡因为重氮化偶联反应促进剂，测定530 nm波长的吸收值。该方法稳定性、回收率好，能用于胆红素的定量分析。

2.2.1.2 薄层扫描法^[21]

以三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸-乙醇(7：7：1.4：0.3)为展开剂展开，日光下即可显示黄色斑点，在420 nm处扫描可测定胆红素的含量。该法要求避光，供试品溶液和对照品溶液均须用棕色瓶贮存，测定前须用干净玻璃片盖在薄层板上以确保测定结果的准确性。本法取样少，准确快速，简便可靠，回收率在97.78%~101.55%之间。

2.2.1.3 红外导数光谱法^[22]

该法选择特征胺基基团(-NH)吸收峰为定量吸收峰，利用二阶导数光谱分离胺基峰，其导数光谱波峰与波谷之间振幅与胆红素含量高低呈线性关系。该法简便、快速，结果准确可靠。

2.2.2 胆酸

2015年版《中国药典》一部采用薄层扫描法测定牛黄、体外培育牛黄中的胆酸含量，人工牛黄与培植牛黄则应用糠醛比色法进行胆酸含量测定。随着科学技术的进步和发展，高分辨率、高灵敏度、高分离效率的胆酸含量测定方法也在逐步完善。

2.2.2.1 毛细管电泳法

将胶束电动色谱法(MEKC)成功应用于人工牛黄及4种中药制剂中胆酸、猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量测定中。所建立的分析方法，在11 min内即实现了多种成分的分离和检测，可为牛黄及其他含有胆酸类药物的复方制剂质量控制提供参考^[23]。

2.2.2.2 高效液相色谱和液质联用法

应用高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用技术(HPLC-ELSD)、高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)，可显著改善胆酸类物质分离检测的准确度和灵敏度。

HPLC-ELSD联用技术：ELSD是一种质量型通用检测器，对不同物质有近似相同的响应因子，可用于多组分的同时分离分析，有利于不同比例混合物的定量分析，对中药多组分的同时测定具有显著优势。应用该技术可建立同时测定多种胆酸类成分含量的方法，比较不同牛黄中胆酸成分的含量，既高效又灵敏，为完善牛黄及其代用品的质量控制标准提供参考^[24]。

HPLC-MS联用技术：HPLC-MS具有高灵敏和高选择性，可用于分析牛黄及牛黄相关制剂中胆酸类成分的体内药代动力学过程，从而阐述药理学差异原因。该法也可用于牛黄及其牛黄代用品中胆酸类成分的快速分析，采用Atlantis d C₁₈色谱柱，选用负离子多反应监测模式，以去氢胆酸为内标，甲醇-乙腈-醋酸铵水溶液为洗脱溶剂，定性、定量分析牛黄中胆酸类成分^[25]。

2.2.3 氨基酸

应用氨基酸自动分析仪分析牛黄及其代用品氨基酸的含量及种类。除极少量的游离氨基酸，其余是以蛋白及肽的形式存在，总量在14.45%~16.10%之间，其中牛磺酸的含量一般都小于1%^[26]。牛黄与体外培育牛黄氨基酸含量相似^[11]，培植牛黄总氨基含量高于牛黄^[15]。文献报道^[27]，人工牛黄中牛磺酸的含量测定方法是以异硫氰酸苯酯作为衍生化试剂衍生后进行HPLC分析的。

2.2.4 无机元素

牛黄及其代用品中无机元素的测定多采用原子吸收分光光度法，根据样品的吸收值不同，测定出不同无机元素的含量^[28]。

3 药理作用 3.1 对中枢神经系统的影响

牛黄及其代用品具有镇静及催眠、抗惊厥抗癫痫、解热镇痛以及抗脑损伤保护脑血管作用^[29]。体外培育牛黄^[30]、培植牛黄^[31]对中枢神经系统作用与天然牛黄相近。

牛黄对中枢神经系统作用的物质基础可能是牛磺酸。在中枢神经系统的生长和再生过程中，牛磺酸是非常重要的营养物质，促进神经系统生长发育、增殖分化，增强动物学习记忆能力，作用机制可能是牛磺酸在一定程度上能增强c-fos基因表达的强度^[32]。同时，适当浓度(6 mmol·L^-1和10 mmol·L^-1)的牛磺酸对高温处理过的神经上皮细胞有保护作用^[33]。研究表明牛磺酸具有抗惊厥抗癫痫作用，其作用机制是直接作用于大脑、小脑、脊髓等神经细胞，表现为抑制性神经递质作用^[34]。

3.2 对心血管及血液循环系统的影响

牛黄、培植牛黄和人工牛黄对血压和心脏具有相同的作用，静脉注射时可降低麻醉动物血压，对心衰模型心脏的正性肌力作用最明显^[35]；体外培育牛黄能显著或极显著地降低动物正常血压，能显著减少离体蛙心的收缩频率和输出量，而对离体蛙心的收缩幅度和大鼠的心电图无显著影响，其对动物心脏和血压的影响与其胆红素含量无正比关系^[36]。

牛黄成分之一的牛磺酸可抑制心室肌细胞钙内流，减轻细胞钙超载，能对抗肾上腺素、地高辛和洋地黄诱发的心律失常^[37]。同时，抑制血管平滑肌细胞增生和内膜增厚，抗高血压和抗动脉粥样硬化，降低血脂，抑制血小板凝集与血栓形成，保护心肌，抗心力衰竭^[38]。

3.3 对消化系统的影响

牛黄及其代用品对胃肠道运动及肠道平滑肌具有解痉、刺激肠蠕动和通便作用。其中，人工牛黄在离体肠管解痉方面不及其他3种牛黄。同时，4种牛黄具有较明显的利胆保肝作用。研究表明，它们的保肝利胆作用可能与所含的主要化学成分熊去氧胆酸、胆汁酸、胆红素及牛磺酸等有关。熊去氧胆酸能显著促进正常大鼠胆汁流量、胆汁胆红素、胆汁总胆汁酸的分泌^[39]，降低胆汁胆固醇的含量，并显著降低血清胆红素、血清总胆汁酸、血清胆固醇水平^[40]，便于胆结石病人的胆固醇逐渐溶解^[41]；胆汁酸分子促进肠道中胆固醇、脂质和脂溶性维生素的吸收^[42]；生理浓度(10 μmol·L^-1)的胆红素基本能完全拮抗苯乙烯诱导的人肝癌HepG2细胞株DNA链断裂损伤^[43]；牛磺酸可以降低肝纤维化小鼠血清中超氧化物歧化酶和丙二醛含量，通过发挥其抗氧化作用减轻四氯化碳诱导的肝纤维化程度^[44]。

3.4 对呼吸系统的影响

牛黄及其代用品具有镇咳和祛痰作用，胆汁酸可能是发挥镇咳和祛痰作用的有效成分。浓氨水引咳法显示结合胆汁酸镇咳作用明显强于游离型^[45]。小鼠酚红法实验发现牛黄及其代用品有明显祛痰作用，猪胆酸和去氧胆酸可能是祛痰作用的有效成分。牛磺结合胆汁酸可直接扩张支气管，对毛果芸香碱、乙酰胆碱、组胺引起的气管平滑肌痉挛具有解痉作用^[46]。

3.5 对免疫系统的影响

牛黄及其代用品化学成分中熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸具有免疫调节作用，熊去氧胆酸可减少免疫介导的肝损伤，促使原发性胆汁性肝硬化患者的淋巴细胞恢复杀伤能力，使淋巴功能恢复正常^[47]。牛磺鹅去氧胆酸无论是对小鼠机体非特异性免疫功能还是对特异性细胞免疫、体液免疫功能都呈剂量依赖性的双向免疫调节作用^[48]。牛磺鹅去氧胆酸能够增强CTX免疫抑制小鼠的免疫功能，恢复免疫抑制小鼠的免疫功能，对免疫失衡机体具有一定的保护作用^[49]。

3.6 抗炎和抗氧化作用

牛黄及其代用品都具有显著的抗炎作用，抑制炎症的渗出和肉芽组织增生，对急性、慢性炎症模型均有效。牛黄及其代用品之间的抗炎作用强度无显著性差别，其抗炎作用也会由于其他中药的配伍而产生明显变化^[50-52]。牛黄能够抑制缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)的表达，减轻在急性肺损伤(ALI)发病过程中HIF-1a作为炎症级联反应中的放大作用，减轻炎性细胞的渗出^[53]。胆红素和各种胆酸同系物是牛黄的抗炎有效成分，去氧胆酸与胆红素均可对抗二甲苯致小鼠耳廓炎症肿胀，但二者合用没有协同作用，其作用机制可能与表面活性强度有关^[54]。

牛黄及其代用品中的胆红素是机体抵抗脂质过氧化，清除自由基的一种天然抗氧化剂，胆红素对正己烷诱发的氧化损伤毒性可能具有一定的保护作用，在防御氧化毒性方面起着重要作用，是机体拮抗自由基氧化损伤的主要防御机制之一^[55]。培植牛黄具有明显的抗肝匀浆脂质过氧化作用，同时，培植牛黄对超氧阴离子自由基和羟自由基具有显著的清除能力，其抗肝匀浆脂质过氧化作用优于牛黄和人工牛黄^[56]。另外，体外培育牛黄具有提高耐缺氧能力和抗氧化酶活性，提高缺氧小鼠的脑、肝、心组织及血清SOD活性，降低MDA含量，能明显减轻脑组织的病理损伤^[57]，并能提高机体清除自由基能力，减轻脂质过氧化作用对心脑细胞的损害，调节神经递质，保护或恢复神经通路，从而达到保护心脑细胞的目的^[58]。

4 结语与展望

目前，牛黄的化学成分基本清楚，主要的活性成分也已经明确，根据这些活性成分建立的质量控制方法仍需改进。研究发现^[59]，人工牛黄和体外培育牛黄所含的主要活性成分并不比天然牛黄低，单纯地检测这些活性成分已经不能满足中药质量控制的需求。使用液质联用技术建立牛黄及其代用品的指纹图谱库，不仅能比较牛黄及其代用品间的差异，也能进行真伪鉴别和质量分析，进而规范市场，提高临床用药质量。

虽然牛黄、培植牛黄、体外培育牛黄与人工牛黄在化学成分、药理作用上具有较大的相似性，但也存在较大的差异。为了接近牛黄的药理活性，可以考虑从牛黄药效物质基础方面来研究开发牛黄的替代品。然而，牛黄的药效物质基础并不明确，尚需加大力度研究。应用代谢组学研究方法有可能有效地解决牛黄药效物质基础的问题，并为研究和开发牛黄新的替代品提供参考。

国家食品药品监督管理局国食药监注[2004]21号《关于牛黄及其代用品使用问题的通知》及国食药监注[2012]355号《关于加强含牛黄等药材中成药品种监督管理的通知》规定“对于国家药品标准处方中含牛黄的临床急重病症用药品种(附品种名单)和国家药品监督管理部门批准含牛黄的新药，可以将处方中的牛黄以培植牛黄、体外培育牛黄替代牛黄等量投料使用，但不得以人工牛黄替代。其他含牛黄的品种可以将处方中的牛黄以培植牛黄、体外培育牛黄或人工牛黄替代牛黄等量投料使用。”，在牛黄及其代用品的临床应用方面，对于一般治疗性药物，用人工牛黄替代牛黄即可取得较好的疗效；而对于临床急救性药物，还是应以牛黄、培植牛黄和体外培育牛黄为佳，可见培植牛黄和体外培育牛黄可作为牛黄临床急重病症用药的代用品，人工牛黄则不允许^[10]。但是，需要指出的是培植牛黄和体外培育牛黄生产的局限性使得这2个替代品的产量难以满足市场的需求，因此有大量成药使用了人工牛黄为原料，所以如何让人工牛黄进入临床急重病症用药是目前面临的一大难题。