B族维生素是维持人体正常机能与代谢活动重要的水溶性维生素，其中多是酶的辅基和酶的组成部分，缺乏时能导致代谢障碍，从而引发多种疾病。而人体自身又无法合成这些化合物，须通过食物或服用复合维生素制剂予以补充。复合维生素B片是由多种维生素、重酒石酸胆碱和肌醇组成的复方制剂，可用于预防和治疗B族维生素缺乏所致的营养不良、厌食、脚气病、糙皮病等。复合维生素B片中含有8种维生素，其中维生素B₁、维生素B₂、维生素B₃、维生素B₅和维生素B₆的含量较高，标示量均为50 mg·片^-1，而叶酸的标示量为400 μg·片^-1，维生素B₁₂与生物素为50 μg·片^-1，最高相差1 000倍。虽然同属水溶性维生素，但化学结构并不相关，理化性质和色谱行为差异大，再加上药品中的含量相差十分悬殊，因此实现同时分析测定的难度较大。

本实验室前期已建立了以高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）技术，同时测定复合维生素B片中维生素B₁、维生素B₂、维生素B₃、维生素B₅和维生素B₆ 5个含量较高的活性成分的方法。由于叶酸、维生素B₁₂以及生物素在药品中的含量很低，并且与5个含量较高成分的溶解性差异大，维生素B₂与维生素B₆在碱液中不稳定，而叶酸和生物素在水中溶解性较差，易溶于稀碱溶液，故采用同一种提取方法无法同时对上述8个维生素进行定量。因此，需要建立一个可以同时测定这3个微量成分含量的方法。

文献报道关于药品或食品中叶酸、维生素B₁₂和生物素的含量测定方法包括紫外分光光度法（UV法）^[1-2]、HPLC法^[3-16]、液相色谱-质谱联用法（LC-MS法）^[17-18]、毛细管电泳法^[19]以及微生物法^[20-21]等。《中华人民共和国药典》（2015年版）^[22]中采用HPLC法对叶酸进行含量测定，以加入0.5 mol·L^-1四丁基氢氧化铵甲醇溶液的磷酸盐缓冲液作为流动相，溶液配制方法较为复杂；利用紫外-可见分光光度法对维生素B₁₂进行含量测定。虽然已有关于叶酸、维生素B₁₂和生物素含量测定方面的报道，但均为单独测定这3种成分中的1个或2个，目前同时对复合维生素B片这种复杂基质中的微量叶酸、维生素B₁₂和生物素进行含量测定的方法尚未见报道。

本研究通过优化提取方法和色谱条件，建立了同时测定复合维生素片中3个微量成分叶酸、维生素B₁₂和生物素的方法，该方法准确、快速，专属性强，可以为该药品的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Agilent 1260液相系统：配有G1311C四元梯度泵、G1329B自动进样器、Alltima C₁₈色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）、G1316A柱温箱、G4212B DAD检测器（Agilent Technologies）；Mettler XP-205电子天平（梅特勒公司）；KQ-800KDE型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Millipore超纯水处理系统。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，Fisher公司，批号158031）；磷酸（色谱纯，Fluka公司，批号BCBB0522）；磷酸二氢铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20130121）；氢氧化钠（分析纯，北京化学试剂公司）；实验用水为超纯水。叶酸对照品（批号15H0968）购自Sigma公司；维生素B₁₂对照品（批号100248-200802）购自中国食品药品检定研究院；生物素对照品（批号20160919）购自国药集团化学试剂有限公司。复合维生素B片（规格：含叶酸400 μg·片^-1，维生素B₁₂和生物素均为50 μg·片^-1，批号3973052、3989178和3972021，Jamieson公司）。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Alltima C₁₈（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-50 mmol·L^-1磷酸二氢铵溶液（磷酸调至pH 3.0）（B），梯度洗脱（0~7 min，13%A；7~15 min，13%A~40%A；15~19 min，40%A）；流速：1.0 mL·min^-1；检测波长：200 nm；柱温：30 ℃；进样体积：50 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取叶酸、维生素B₁₂、生物素的对照品适量，叶酸和生物素用0.1%氢氧化钠溶液溶解，分别配制成质量浓度约480 μg·mL^-1和60 μg·mL^-1的储备液，维生素B₁₂用水溶解，配制成质量浓度约60 μg·mL^-1的储备液。分别精密量取各储备液10 mL于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，配制成叶酸质量浓度约48 μg·mL^-1以及维生素B₁₂和生物素浓度均约6 μg·mL^-1的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液2.5、4、5、6、7.5 mL，分别置于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，获得叶酸质量浓度约为12、19.2、24、28.8、36 μg·mL^-1，维生素B₁₂和生物素浓度均约为1.5、2.4、3、3.6、4.5 μg·mL^-1的混合对照品溶液。中间浓度的混合对照品溶液（浓度和供试品溶液的相当）作为标准工作液，应用于方法的系统适用性研究。以上所有溶液均在棕色量瓶中配制，避光操作。混合对照品溶液进样前，经0.22 μm微孔滤膜滤过。

2.3 供试品溶液的制备

取复合维生素B片20片，精密称定，研细，精密称取粉末适量（约相当于叶酸1.2 mg，维生素B₁₂ 0.15 mg，生物素0.15 mg），置于50 mL量瓶中，加入0.1%氢氧化钠溶液30 mL，振荡2 min，超声（800 W，40 kHz）60 min，加0.1%氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。以上过程应避光操作。

2.4 阴性溶液的制备

依据复合维生素B片说明书提供的辅料配方，按“2.3”项下方法操作，制备阴性溶液。

2.5 专属性试验

分别对阴性溶液、混合对照品溶液和供试品溶液进样分析，考察样品中辅料对待测成分色谱峰的干扰。阴性溶液、混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图（图 1）显示：样品中辅料和其他成分不干扰叶酸、维生素B₁₂和生物素的测定。

2.6 系统适用性、线性关系考察及检测下限及定量下限测定

取标准工作液连续进样6次，考察叶酸、维生素B₁₂和生物素色谱峰的平均理论塔板数、对称因子和分离度，结果见表 1。分别精密吸取“2.2”项下各浓度混合对照品溶液50 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X（μg·mL^-1）为横坐标作标准曲线，得到回归方程和线性相关系数（r）。将混合对照品溶液逐级稀释后，以信噪比（S/N）约为3.0时的质量浓度为各成分的检测下限（LOD），S/N约为10.0时的质量浓度为各成分的定量下限（LOQ）。结果见表 2。

2.7 精密度试验

对批号为3973052的1份供试品溶液连续进样6次，计算得到叶酸、维生素B₁₂和生物素色谱峰峰面积的RSD（n=6）分别为0.063%、0.10%和0.31%，表明仪器的精密度良好。取低、中、高浓度的3份混合对照品溶液，每隔4 h进样1次，做日内精密度试验；每隔12 h进样1次，做日间精密度试验，连续做3 d。根据峰面积积分值计算分析日内及日间精密度，结果见表 3。

2.8 重复性试验

对批号3973052的样品独立制备供试品溶液6份，分别进样分析，计算得到叶酸、维生素B₁₂和生物素的含量测定结果分别为484.1、48.31和51.89 μg·片^-1，RSD（n=6）分别为1.8%、0.51%和0.41%，说明方法的重复性良好。

2.9 回收率试验

取空白基质约2.0 g，精密称定，再分别精密加入混合对照品储备液适量，按照“2.3”项下方法操作，制备各回收率溶液，在相当于供试品溶液80%、100%、120%的浓度水平下，分别考察回收率。每个浓度制备3份，共9份供试溶液。以实际测得量和理论加入量的比值作为回收率，计算回收率的RSD，结果见表 4，表明方法回收率良好。

2.10 稳定性试验

对批号为3973052的供试品溶液分别于配制后的0、2、4、8、12、24 h进样分析，计算得到24 h内叶酸、维生素B₁₂和生物素色谱峰峰面积的RSD（n=6）分别为0.12%、0.11%和0.98%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.11 样品测定

应用建立的方法对批号为3973052、3989178和3972021的复方维生素B片进行含量测定，每个样品测定2份，取平均值。测定结果见表 5。

3 讨论 3.1 检测波长的选择

根据各成分在流动相中的紫外吸收谱图来确定检测波长。叶酸、维生素B₁₂和生物素的紫外谱图分别在196、206、195 nm处有最大吸收，兼顾3个成分综合考虑，在200 nm处均有较强吸收，并且3个成分的含量低，在200 nm处色谱峰的响应值适合定量，故选择200 nm作为检测波长。

3.2 色谱条件的优化

本研究采用乙腈-50 mmol·L^-1磷酸二氢铵溶液（磷酸调至pH 3.0）为流动相，叶酸、维生素B₁₂和生物素色谱峰的对称性及理论塔板数均良好，并且可以保证样品中的其他活性成分和辅料不干扰3个待测成分的测定。考察了不同梯度洗脱程序，并比较了不同流速（0.5、0.8、1.0 mL·min^-1）、不同进样体积（5、10、20、50 µL）的影响，在最终确定的色谱条件下，3个待测成分间以及与样品中含量高的活性成分、辅料中的其他成分之间分离度良好，保留时间适宜，在15 min内即可实现对3个成分的含量测定。

3.3 提取方法的选择

叶酸和生物素易溶于稀碱溶液，而在水中的溶解性较差。本研究比较了用不同浓度的氢氧化钠溶液（0.01%、0.05%、0.1%）作为提取溶剂对3个成分的影响，结果显示用0.1%氢氧化钠提取时可以将3个待测成分提取完全，故选为最终的提取溶剂。比较了不同超声提取时间（15、30、60 min），结果显示超声时间为60 min时对各成分的提取率最高，因3个待测成分的含量低，采用短时间超声难以将其提取完全。比较了不同取样量（0.2、0.5、0.8、3片）的影响，结果显示当取样量为0.2片、0.5片和0.8片时叶酸、维生素B₁₂和生物素的峰高较低，不适合定量分析，当取样量为3片量（约相当于叶酸1.2 mg，维生素B₁₂ 0.15 mg，生物素0.15 mg），加提取溶剂定咅至50 mL时各成分的响应值合适。叶酸和维生素B₁₂对光较敏感，本研究采取避光操作，并且采用棕色量瓶和液相进样小瓶，结果显示对照品及样品的溶液在避光条件下稳定性良好。

3.4 方法学验证

本研究的方法学验证参照国际通行的ICH方法学验证原则^[23-24]进行，内容包括系统适用性（理论塔板数、对称因子、分离度）、线性、检测限、定量下限、专属性、精密度、重复性、稳定性、准确度（回收率），结果表明建立的分析方法准确、可靠，适合于复合维生素B片中微量叶酸、维生素B₁₂和生物素的准确测定，可为复合维生素B片的质量控制提供参考。