2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
中药材、中药饮片非法染色掺假的现象在国内普遍存在，主要包括（1）将其他物质染色后掺入冒充中药材或饮片；（2）将药材劣品或不合格药材及饮片经过染色，更改外观以冒充高品质药材[1-3]。目前已发现有染色掺假的中药材、中药饮片有几十种，大部分染色剂都有毒性，它们对人体均可造成不同程度的危害。目前，国内外已有的检测染色剂的文献报道绝大多数是针对食品中的染色剂，而对于中药材中的染色剂，特别是多种色素，同时检测却少有研究报道[4-5]。2012年，国家食品药品监督管理局针对染色比较普遍的中药发布了关于色素补充检验通知（即《中药材及中药饮片药品检验补充检验方法和检验项目批准件》），但该通知仅涉及金胺O、柠檬黄、胭脂红、日落黄等10多种色素的检测，对非法使用标准之外的合成着色剂无能为力，因此建立中药材及饮片中合成着色剂的高通量筛查方法十分必要[6-10]。
本研究建立了超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）同时测定中药材及饮片中29种合成着色剂的分析方法。该方法确定了色素的质谱检测条件以及各色素的最佳检测模式、母离子以及定性、定量离子等质谱信息，并结合色谱数据将色素分段进行考察，检验灵敏度高，选择性和重复性均较好，各项性能指标满足合成着色剂检测的要求。
1 仪器与试药Agilent 1290 Infinity超高压液相色谱仪（6490 Triple Quad LC/MS、ESI源，美国安捷伦公司），ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Waters公司）；Milli-Q超纯水机（Millipore有限公司）；Mettler Toledo MS电子天平；KQ-500DE型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。
金橙Ⅰ（国药集团化学试剂有限公司，批号F20110711）、金橙Ⅱ（阿拉丁试剂有限公司，批号D1205024）、金橙Ⅳ（国药集团化学试剂有限公司，批号F20121210）、橙黄G（国药集团化学试剂有限公司，批号F20120311）、甲基橙（国药集团化学试剂有限公司，批号20070815）、罗丹明B（阿拉丁试剂有限公司，批号D120502）、碱性橙2（德国CNW试剂有限公司，批号6A15G020）、碱性橙21（德国CNW试剂有限公司，批号1C46K025）、碱性橙22（德国CNW试剂有限公司，批号6A16G050）、酸性红73（TCI试剂有限公司，批号BTGGK-PG）、柠檬黄（批号30117）、日落黄（批号91001）、亮蓝（批号20115）、靛蓝（批号10825）均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；苏丹红Ⅰ（批号SB05-266-2012，1 mg·mL-1）、苏丹红Ⅱ（批号SB05-267-2012，1 mg·mL-1）、苏丹红Ⅲ（批号SB05-268-2012，1 mg·mL-1）、苏丹红Ⅳ（批号SB05-269-2012，1 mg·mL-1）由农业部环境保护科研监测所提供、诱惑红（批号GBW（E）100164，1 mg·mL-1）、赤藓红（批号GBW（E）100164，1 mg·mL-1）、胭脂红（批号GBW（E）100004a，1 mg·mL-1）、苋菜红（批号GBW（E）100002a，1 mg·mL-1）、新品红（批号111955-201301）、808猩红（批号111940-201201）均由国家药品标准物质中心提供。
甲醇（HPLC级，04DG3H，霍尼韦尔贸易有限公司），乙酸铵（LC/MS，120294，Fisher科技有限公司），水为Millipore超纯水，其余试剂均为分析纯。
中药材及饮片：红花、丹参、枸杞、血竭、朱砂、五味子、酸枣仁、黄芩、黄连、蒲黄、黄柏、槲寄生、延胡索、青黛、女贞子、山茱萸、何首乌（制）、生地黄、熟地黄、均购自亳州药材市场，经山东中医药大学田景振教授鉴定。
2 方法 2.1 标准溶液的制备分别精密称取各固体色素对照品约0.100 0 g，用甲醇定容至100 mL，制成约1 000 mg·L-1的单标储备液，4 ℃条件下保存。取上述各单标储备液，诱惑红、赤藓红、胭脂红、苋菜红对照品溶液及苏丹红Ⅰ-Ⅳ对照品溶液各1 mL置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备[11-12]取待测药材（饮片）粉碎，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液10 mL，称定，超声处理（功率250 W，频率100 kHz）20 min，放冷至室温，再称定，用70%甲醇水溶液补足减失的量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液即得。
2.3 液相色谱-串联质谱条件色谱条件：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），流动相A为0.02 mol·L-1醋酸铵溶液，B为甲醇；梯度洗脱（0~6 min，90%A→ 70%A；7~15 min，70%A→55%A；16~20 min，55%A→40%A；21~25 min，40%A→10%A；21~25 min，10%A），流速0.2 mL·min-1，柱温35 ℃。质谱条件：正离子电喷雾离子化（ESI+）选择反应监测，干燥气流温度200 ℃，干燥气流流速14 L·min-1，喷雾器压力0.14 MPa，鞘气温度250 ℃，鞘气流速11 L·min-1，毛细管电压3.0 kV，喷嘴电压1.5 kV，Vcap电压5.0 kV。
3 结果与讨论 3.1 提取条件的优化[13]比较了乙醇、甲醇、水3种提取溶媒及其不同比例的溶液，结果表明70%甲醇水提取率最高；以70%甲醇水为提取溶媒，比较了3种不同的提取方法：加热回流提取法、微波提取法、超声提取法，结果超声提取法操作简便，提取率略高于前2种提取方法；采用超声提取法，分别考察了加入10、20、30 mL 70%甲醇水的提取效果，结果表明70%甲醇水20、30 mL的色素提取量无差异，故选择70%甲醇水20 mL进行提取；采用超声法，加入70%甲醇水20 mL，又分别考察了提取10、15、20、25、30、40 min的提取效果，结果表明多数品种20 min后，延长提取时间，提取量无差异，且容易提取出检测色素外的其他成分，故选择20 min作为提取时间。
3.2 质谱条件的优化[14-15]分别在正离子和负离子模式下对各色素单一对照溶液进行全扫描，选出合适的电离方式及母离子；在确定ESI离子监测模式后，分别以分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，选取丰度较强及干扰较小的2个子离子分别作为定量离子和定性离子；以选择反应监测（SRM）方式，优化了目标化合物二级质谱的碰撞能量等质谱分析参数，结果详见表 1。
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表 1 合成着色剂质谱信息 Table 1 MS/MS parameters for the 29 synthetic colorants |
以峰面积Y为纵坐标，各化合物的含量X为横坐标，建立标准曲线，29种合成着色剂线性关系均良好，线性方程和相关系数见表 2，线性范围为0.19~27.3 μg·mL-1；方法的检测下限为0.1~0.26 ng。采用标准添加法，选择未检出色素的空白样品，分别添加0.02 mg·mL-1的29种色素混合对照品溶液1 mL，平行测定6次，回收率及精密度数据见表 3，平均回收率范围为86.3%~116.3%，方法的相对标准偏差为0.61%~ 3.8%。
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表 2 合成着色剂的线性范围内，回归方程，相关系数和检出下限（n=5） Table 2 Linear ranges, equation of calibration, correlation coefficients, and detection limits of synthetic colorants studied |
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表 3 日内和日间精密度和回收率（n=6） Table 3 Intra-day and inter-day precisions and recoveries |
应用本方法对30批市售红花、血竭、朱砂、延胡索等样品进行测定，结果果检表 4。
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表 4 阳性样品UPLC-MS/MS检验结果 Table 4 Test results of positive samples |
本文建立了采用UPLC-MS/MS法同时测定中药材及饮片中可能添加的29种合成着色剂，在30 min内即完成了对各化合物的分析测定。该方法前处理简单，灵敏度高，线性关系、准确度和精密度等均满足方法学指标要求。与液相色谱方法相比，进一步提高了方法的准确性和灵敏度，检测的色素种类较为全面，有效地提高了检测速度和检测通量，可为监测中药材中非法染色提供强有力的技术支持[16]。
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