一测多评法测定洋常春藤及其提取物中4个主要皂苷类成分

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药物分析杂志

2018, Vol. 38

Issue (6): 986-996. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.06.10

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本文结构
摘要
关键词
Abstract
Keywords
1 仪器与试药
1.1 仪器
1.2 试药
2 方法与结果
2.1 常春藤提取物的制备
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液
2.2.2 药材供试品溶液^[8]
2.2.3 提取物供试品溶液
2.3 色谱条件
2.4 方法学考察
2.4.1 系统适应性及专属性试验
2.4.2 标准曲线的绘制
表1(Table 1)
2.4.3 精密度试验
2.4.4 稳定性试验
2.4.5 重复性试验
2.4.6 加样回收率试验
2.5 相对校正因子f_k/s的确定
2.6 相对校正因子的耐用性验证
2.6.1 不同高效液相色谱仪
表2(Table 2)
2.6.2 不同色谱柱
表3(Table 3)
2.6.3 不同检测波长
表4(Table 4)
2.6.4 不同柱温
表5(Table 5)
2.6.5 不同流速
表6(Table 6)
2.7 QAMS法待测成分色谱峰的定位
表7(Table 7)
2.8 一测多评法与外标法分析结果的比较
表8(Table 8)
表9(Table 9)
3 讨论
参考文献

成分分析

引用本文 [复制中英文]

倪力军, 丁璐, 张立国, 栾绍嵘, 金汉台, 朱美鹏, 金志文. 一测多评法测定洋常春藤及其提取物中4个主要皂苷类成分[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(6): 986-996. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.06.10.

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NI Li-jun, DING Lu, ZHANG Li-guo, LUAN Shao-rong, JIN Han-tai, ZHU Mei-peng, JIN Zhi-wen. Simultaneous determination of four saponins in Hedera helix and its extracts by quantitative analysis on multi-components by a single marker[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2018, 38(6): 986-996. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.06.10.

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第一作者

倪力军, Tel:(021)64253045;E-mail:nljfyt@163.com。

文章历史

收稿日期：2017-08-15

Contents Abstract Full text Figures/Tables PDF

一测多评法测定洋常春藤及其提取物中4个主要皂苷类成分

倪力军 ¹, 丁璐 ¹, 张立国 ¹, 栾绍嵘 ¹, 金汉台 ², 朱美鹏 ², 金志文 ²

1. 华东理工大学, 上海 200237;
2. 浙江康恩贝中药有限公司, 松阳 323400

收稿日期：2017-08-15

第一作者：倪力军, Tel:(021)64253045;E-mail:nljfyt@163.com

摘要：目的：建立洋常春藤及其提取物中常春藤萜苷C、α-常春藤素、常春藤萜苷D、常春藤皂苷B等4个主要皂苷成分一测多评定量检测法。方法：以常春藤萜苷C为参照成分，建立该成分与α-常春藤素、常春藤萜苷D、常春藤皂苷B的相对校正因子，采用校正因子计算这3个常春藤皂苷的含量。考察不同品牌色谱仪、色谱柱、检测波长、柱温、流速下各相对校正因子的变化，评价各校正因子的耐用性。分别采用外标法和所建立的一测多评法测定23批洋常春藤及30批提取物中4个皂苷类成分含量并比较两者的差异，以评价"一测多评"法的准确性。结果：23批洋常春藤中α-常春藤素、常春藤皂苷B、常春藤萜苷D的"一测多评"法测得含量与外标法结果之比分别为（100.56±0.29）%、（99.37±0.32）%、（99.52±0.18）%，30批提取物中相应成分2种方法的比值分别为（100.86±0.87）%、（99.84±0.02）%、（99.84±0.03）%；药材及提取物中2种方法所对应上述皂苷成分的相对偏差RE分别在0.10%~3.28%、0.12%~1.53%、0.11%~0.83%之间；3个常春藤皂苷的相对校正因子在不同仪器、不同色谱柱、不同检测波长、不同柱温及不同流速下的RSD分别为1.1%~3.6%、1.6%~2.0%、0.47%~3.1%、1.5%~2.9%与0.55%~2.5%，耐用性良好。结论：本文所建常春藤皂苷成分同时定量的一测多评方法准确度高、重复性及耐用性好，可用于洋常春藤及其提取物质量的常规检验与快速分析。

关键词：一测多评洋常春藤常春藤提取物常春藤皂苷相对校正因子耐用性评价

Simultaneous determination of four saponins in Hedera helix and its extracts by quantitative analysis on multi-components by a single marker

NI Li-jun¹, DING Lu¹, ZHANG Li-guo¹, LUAN Shao-rong¹, JIN Han-tai², ZHU Mei-peng², JIN Zhi-wen²

1. East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;
2. Zhejiang CONBA Chinese Medicine Co., LTD., Songyang 323400, China

Abstract: Objective: To establish a method for simultaneously determination of the contents of four saponins(hederacoside C, α-hederin, hederacoside D, hederasaponin B)in Hedera helix L.and its extract by quantitative analysis of multi-components by single-marker(QAMS).Methods: Taking hederacoside C as the reference substance, the relative correction factors(RCF)of α-hederin, hederacoside D and hederasaponin B were determined for assay of the three saponins by QAMS.The variance of the three RCFs caused by different instruments, chromatographic columns, detection wavelengths, column temperatures and flow rates was investigated to evaluate the durability of the factors.The contents of the three saponins in 30 batches of H. helix.and the corresponding extracts were determined by both external standard method and QAMS, respectively.The results of the two methods were compared to evaluate the accuracy of QAMS.Results: The ratio of the contents of the three saponins determined by QAMS to that by external standard method in 23 batches of the leaves of H helix and 30 batches of ivy extracts was(100.56±0.29)%, (99.37±0.32)%, (99.52±0.18)% and(100.86±0.87)%, (99.84±0.02)% and(99.84±0.03)%, respectively; the relative error of the corresponding saponins determined by two methods in H. helix and its extracts was in the range of 0.10%-3.28%, 0.12%-1.53% and 0.11%-0.83%, respectively.And the three RCFs were consistent at different instruments, chromatographic columns, detection wavelengths, column temperatures and flow rates with the RSD within 1.1%-3.6%, 1.6%-2.0%, 0.47%-3.1%, 1.5%-2.9% and 0.55%-2.5%, respectively.Conclusions: The established QAMS method has high accuracy and better repeatability and durability, it could be applied in routine and fast determination of main saponins in H. helix and its extract.

Key words: quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS) Hedera helix L. extract of Hedera helix L. Hedera helix L.saponins relative correction factor (RCF) durability

常春藤(Hedera helix L.)，属五加科常春藤属多年生常绿攀援灌木，根据《中华本草》记载，其功能主治为祛风、利湿、和血、解毒，用于风湿痹痛、月经不调、跌打损伤、咽喉肿痛、痈疖肿毒^[1]。常春藤植物茎叶中含三萜皂苷、黄酮、氨基酸、酚酸、挥发油等类化合物^[2]，其中皂苷类化合物是常春藤的主要药效成分，也是研究最多，且发现种类较多的一类成分^[3]。常春藤皂苷具有显著的生物活性，能够促进新陈代谢，调节免疫系统，有一定的抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用^[4]。大量药理与临床研究表明^[5-7]，以洋常春藤醇提取物为原料的糖浆、片剂、滴剂在欧美等地被临床用于治疗哮喘及支气管炎，其皂苷类成分被认为是常春藤制剂的主要药效部位，其中α-常春藤素(α-hederin，α-H)和常春藤萜苷C(hederacoside C，HDC)具有多种药理活性，是常春藤制剂中的主要药效物质，因而被作为欧洲药典中洋常春藤的定性与定量检测成分^[8]，且规定常春藤药材中HDC含量大于3%。此外，常春藤中还含有常春藤皂苷B(hederasaponin B，HDB)、常春藤萜苷D(hederacoside D，HDD)、E、F、G、H、I等母核相同但结合糖链不同的多种三萜皂苷类成分^[9]。为研发以常春藤醇提取物为原料的天然药物创新药，本课题组利用大孔吸附树脂纯化精制其醇提物，得到总皂苷含量大于55%的常春藤提取物^[10]，经过分离和分析，从中鉴别出HDC、α-H、HDD、HDB 4个常春藤皂苷成分。

文献^[11]报道了采用高效液相色谱同时测定常春藤中上述4个皂苷成分含量的方法，但由于中药多指标的质量分析、控制模式下对照品的种类和数量均比较大，且部分对照品(如α-H、HDB译)价格比较昂贵且难以从资信度高的机构购到。由于此4个皂苷具有相同的母核(其分子结构如图 1所示)，故可利用一测多评(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)中药质量评价模式^[12]同时测定其在常春藤及其提取物中的含量。

A.α-H B. HDB C. HDC D. HDD 图 1 4个常春藤皂苷类化合物的分子结构图 Figure 1 Structures of four saponins in Hedera helix L.

本研究以HDC为参照成分，建立HDC与α-H、HDD、HDB等3个常春藤皂苷成分之间的相对校正因子，外标法测定样品中HDC的量，通过相对校正因子计算其余3个常春藤皂苷的含量，实现对洋常春藤及其提取物的多指标快速质量评价。并就该一测多评方法对不同品牌色谱仪、色谱柱及不同柱温、波长、流速等条件的适应性、耐用性进行考察，评价该方法在洋常春藤及其提取物质量分析中应用的准确性和可行性。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Shimadzu LC-20AD XR高效液相色谱仪，LC solutionDB工作站(日本岛津国际贸易公司)；Thermo U3000高效液相色谱仪，Chromelon 7.0工作站(德国赛默飞世尔科技有限公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪，ChemStation工作站(美国Agilent公司)；Agilent Eclipse XDB C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，下同)；Waters Xterra RP C₁₈色谱柱; InertSustain Swift C₁₈色谱柱ML104/02万分之一天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；CPA 225D十万分之一天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；DS-3510DTH超声波清洗仪(上海生析超声仪器有限公司)；FW177中药粉碎机(天津泰斯特仪器公司)；Mili-Q超纯水仪(美国Milipore公司)。

1.2 试药

HDC对照品(批号BCBR3338V，质量分数为94.6%)购自Sigma-Aldrich有限公司，对照品α-H(批号CTZG20160330，质量分数为98.11%)、HDB(批号CCTB20160222，质量分数为98.9%)与HDD(批号CHGD20150820，质量分数为98.63%)均购自南京春秋生物工程有限公司。乙腈(色谱纯，ACS，批号45Y1612ST)；甲醇(色谱纯，Merk，批号1856907644)；甲醇(分析纯，上海泰坦科技股份有限公司，批号P1239404)；乙醇(分析纯，上海泰坦科技股份有限公司，批号P1176855)；Milipore超纯水。

23批常春藤鲜叶分别采自广东、山东、江苏沭阳、浙江杭州和上海市徐汇区，经中国中医科学院中药所陈士林研究员鉴定为五加科植物常春藤属译常春藤Hedera helix L.。

2 方法与结果 2.1 常春藤提取物的制备

称取适量译常春藤干叶粉碎成粗粉，用80%乙醇水回流提取2次(85~90 ℃)，第1次加9倍量回流1 h，第2次加5倍量回流0.5 h，滤过，合并滤液，回收乙醇至无醇味，用6倍量水溶解，在4 ℃条件下静置过夜，滤过，通过DM130大孔吸附树脂柱，水洗脱至无色，再用30%(3倍量)和70%(3倍量)浓度的乙醇水洗脱，收集70%乙醇水洗脱液，滤液浓缩，干燥，粉碎，即得。

2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液

分别精密称取HDC、α-H、HDB、HDD对照品12.54、3.21、1.95、1.45 mg于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容制成混合对照品溶液。再分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于5 mL量瓶中，用甲醇稀释得到5个浓度系列的混合对照品溶液。

2.2.2 药材供试品溶液^[8]

精密称取药材粉末1 g，置100 mL圆底烧瓶中，加50 mL 80%甲醇水溶液回流1 h，冷却后脱脂棉过滤，再加30 mL 80%甲醇水溶液回流0.5 h，合并滤液定容至100 mL量瓶中，摇匀，过0.22 μm滤膜，即得药材供试品溶液。

2.2.3 提取物供试品溶液

精密称取本品粉末10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超声(功率180 W，频率40 kHz)溶解并定容至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

Shimadzu LC-20AD XR高效液相色谱仪，Agilent Eclipse XDB C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0~5 min，25%B；5~13 min，25%B→28%B；13~23 min，28%B→35%B；23~35 min，35%B→42%B；35~45 min，42%B→62%B；45~50 min，62%B→25%B)。流速1.0 mL·min^-1，进样量10 μL，检测波长205 nm，柱温25℃。

2.4 方法学考察 2.4.1 系统适应性及专属性试验

精密量取混合对照品溶液、药材及提取物供试品溶液及空白溶液各10 μL，在上述色谱条件下进样分析。结果显示，供试品溶液色谱图中呈现与对照品保留时间相同的色谱峰；HDC、α-H、HDB、HDD与其相邻色谱峰的分离度均大于1.4，拖尾因子在0.97~1.10，理论板数以HDC计大于30 000，阴性对照在相应位置处未见色谱峰，方法专属性良好。混合对照品、供试品HPLC图见图 2。

HDC 2.α-H 3. HDB 4. HDD 图 2 混合对照品(A)和常春藤提取物供试品(B)、常春藤药材供试品(C)HPLC图 Figure 2 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A), extract of Hedera helix (B) and Hedera helix (C)

2.4.2 标准曲线的绘制

分别精密吸取混合对照品溶液，制成5个不同质量浓度的对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进行测定。记录相应的色谱峰峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)，进行线性回归。实验结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。结果见表 1。

表 1 4个常春藤皂苷成分的线性关系考察结果 Table 1 Linearities of four saponins in Hedera helix

2.4.3 精密度试验

精密吸取常春藤供试品溶液10 μL，连续进样6次，记录HDC、HDD、HDB、α-H峰面积的RSD分别为0.17%、0.40%、0.33%、0.39%(n=6)。表明仪器的精密度良好。

2.4.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于样品制备后0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积，计算RSD。HDC、HDD、HDB、α-H4个皂苷类成分峰面积的RSD分别为0.39%、1.8%、0.60%、1.5%。表明样品在24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验

取样品适量，平行制备6份供试品溶液并依法测定。结果HDC、HDD、HDB、α-H的平均质量分数分别为62.41%、4.19%、2.62%、4.56%，其RSD分别为0.48%、1.1%、2.2%、0.63%(n=6)，表明本法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验

精密称取已测定含量的样品6份，每份25 mg，分别加入一定量的对照品，按照供试品溶液的制备方法制备样品溶液，进行测定回收率。结果表明，HDC、HDD、HDB、α-H的平均回收率分别为99.8%、105.6%、95.0%、99.1%，RSD分别为0.88%、2.0%、1.5%、1.1%。表明该方法的准确度良好。

2.5 相对校正因子f_k/s的确定

在标准曲线Y=aX+b中，X=(Y-b)/a=Y/a-b/a，由于b通常为误差引起，在a/b大于100时，b/a可以忽略不计，此时可以按X=Y/a直接计算含量。由表 1可知，4个常春藤皂苷成分标准曲线的斜率与截距之比在699~28 711之间，均远大于100。故α-H、HDD、HDB 3个皂苷的校正因子可以与其HDC标准曲线的斜率a之比直接计算，校正因子计算公式为f_k/s=a_k/a_s，即以参照物快速推算其余待测化学成分的含量，计算公式为：C_k=A_k/(a_sf_k/s)。式中a_s为参照物斜率，a_k为待测组分对照品斜率，C_k为待测组分浓度，A_k为待测组分峰面积。

2.6 相对校正因子的耐用性验证 2.6.1 不同高效液相色谱仪

取“2.2.1”项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，采用Agilent Eclipse XDB C₁₈色谱柱，分别在Shimadzu LC-20AD XR、Thermo U3000和Agilent 1200 3种高效液相色谱仪上进样检测，按“2.5”项中的方法，求算以HDC作为参照成分时其他3个成分的相对校正因子，采用不同仪器测定得到各待测成分的3个相对校正因子的RSD评价相对校正因子的耐用性，表 2结果显示，RSD在1.1%~3.6%，说明相对校正因子对于3种常用高效液相色谱仪的耐用性良好。

表 2 使用不同高效液相色谱仪测定并计算得到的各待测成分的相对校正因子 Table 2 f_k/s obtained on different HPLC instruments

2.6.2 不同色谱柱

取“2.2.1”项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，在Shimadzu LC-20AD XR高效液相色谱仪上，分别采用Waters Xterra RP C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Eclipse XDB-C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Inert Sustain Swift C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)3种色谱柱进行检测，按“2.5”项中的方法，求算以HDC作为参照成分时其他3个成分的相对校正因子。表 3结果表明，使用不同色谱柱测定时各相对校正因子RSD在1.61~2.00，说明3个相对校正因子对于所考察的3种色谱柱耐用性良好。

表 3 使用不同高效液相色谱柱测定并计算得到的各待测成分的相对校正因子 Table 3 f_k/s obtained on different columns

2.6.3 不同检测波长

取“2.2.1”项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，采用Shimadzu LC-20AD XR高效液相色谱仪及Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱进样检测，按“2.5”项中的方法，分别计算采用200、203、207、210 nm作为检测波长时，以HDC为参照成分时其他3个成分的相对校正因子。表 4结果表明，不同检测波长下相对校正因子的RSD在0.47%~3.1%，说明波长在200~210 nm范围变动时，相对校正因子的耐用性良好。

表 4 使用不同检测波长测定并计算得到的各待测成分的相对校正因子 Table 4 f_k/s obtained at different detective wavelengths

2.6.4 不同柱温

取“2.2.1”项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，采用Shimadzu LC-20AD XR高效液相色谱仪及Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱进样检测，按“2.5”项中的方法，分别计算采用20、25、30 ℃柱温时，以HDC为参照成分时其他3个成分的相对校正因子。表 5结果表明，不同柱温下相对校正因子的RSD在1.5%~2.9%，说明相对校正因子在20~30 ℃柱温范围耐用性良好。

表 5 使用不同柱温测定并计算得到的各待测成分的相对校正因子 Table 5 f_k/s obtained at different column temperatures

2.6.5 不同流速

取“2.2.1”项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，采用Shimadzu LC-20AD XR高效液相色谱仪及Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱进样检测，按“2.5”项中的方法，分别计算采用0.9、1.0、1.1 mL·min^-1流速时，以HDC为参照成分时其他3个成分的相对校正因子。表 6结果表明，不同流速下相对校正因子的RSD在0.55%~2.5%，说明相对校正因子在0.9~1.1 mL·min^-1流速范围耐用性良好。

表 6 使用不同流速测定并计算得到的各待测成分的相对校正因子 Table 6 f_k/s obtained at different flow rates

2.7 QAMS法待测成分色谱峰的定位

实验中分别考察混合标准溶液的相对保留值(待测成分与参照成分保留时间的比值)和保留时间差(保留时间差值的绝对值)在3种品牌仪器、3种品牌色谱柱中的重现性(以RSD评价)。表 7结果表明，保留时间差的波动较为明显，相对保留值的波动较小。即便如此，最后1个出峰的α-H的相对保留值在不同仪器及不同色谱柱上的RSD远大于HDD和HDB：α-H的相对保留值在同一台仪器(Shimadzu LC20AD XR)上不同色谱柱下的RSD为11.3%，在不同仪器上利用同一根色谱柱(Agilent Eclipse XDB-C₁₈)上的RSD为11.3%。由图 1可知，α-H为单糖链皂苷，其结构与其他3个双糖链皂苷有所不同：导致其极性较弱，在3个皂苷中最后出峰。鉴于α-H与其他皂苷类成分分离较好且较易从色谱图中直观辨别，故采用相对保留时间进行常春藤中这4个皂苷成分色谱峰的定位较为可行。

表 7 4个常春藤皂苷在不同色谱仪及色谱柱的保留时间差值及相对保留值(x±s，n=5) Table 7 The differences of retention time and relative retention time of the four saponins determined on different instruments and different columns

2.8 一测多评法与外标法分析结果的比较

表 8、表 9分别给出了外标法和一测多评法(以HDC作为参照成分时)测得的23批来自不同产地，于不同采摘期及不同炮制温度下的译常春藤及30批不同药材和不同提取工艺条件下的提取物样品中4个常春藤皂苷成分的质量分数，以及外标法与以HDC为参照成分时的一测多评法所得另外3个常春藤皂苷成分含量的相对偏差(RE值)范围，及2种方法所测皂苷含量的比值(W_s/W_f)。两表结果表明，以HDC为参照成分时，药材中α-H、HDB、HDD的RE值范围分别为0.10%~1.1%、0.16%~1.5%、0.13%~0.83%，提取物中相应皂苷成分的RE值范围分别为0.13%~3.3%、0.12%~0.22%、0.11%~0.22%；药材中α-H、HDB、HDD常春藤皂苷的W_s/W_f的比值分别为(100.56±0.29)%、(99.37±0.32)%、(99.52±0.18)%、提取物中相应皂苷成分的W_s/W_f的比值分别为(100.86±0.87)%、(99.84±0.02)%、(99.84±0.03)%，说明本文建立的常春藤皂苷成分“一测多评”法的准确度良好。

表 8 “一测多评”法与外标法所测23批常春藤中4个皂苷含量及比较 Table 8 Contents of the four saponins in 23 batches of H. helix determined by both QAMS method and external standard method

No.	样品编号 (Lot No.)	药材产地 (herb origin)	HDC¹	α-H²				HDB²				HDD²				总和(total)
No.	样品编号 (Lot No.)	药材产地 (herb origin)	W_s	W_s	W_f	RE	W_s/W_f	W_s	W_f	RE	W_s/W_f	W_s	W_f	RE	W_s/W_f	W_s	W_f	RE	W_s/W_f
1	GD160811^a	广东 (Guangdong)	6.35	0.76	0.76	1.09	101.10	0.74	0.74	0.24	99.76	1.14	1.15	0.22	99.44	9.00	9.00	0.04	100.08
2	SH160903^c	上海 (Shanghai)	3.02	1.93	1.92	0.44	100.45	0.11	0.12	1.53	98.49	0.39	0.40	0.56	99.54	5.46	5.46	0.08	100.03
3	JS160927^a	江苏 (Jiangsu)	5.89	0.81	0.80	1.03	101.04	0.55	0.56	0.32	99.68	0.79	0.80	0.30	99.26	8.05	8.04	0.05	100.06
4	ZJ170222-1^c	浙江 (Zhejiang)	5.52	2.50	2.49	0.35	100.35	0.33	0.34	0.52	99.48	0.29	0.29	0.75	99.17	8.64	8.64	0.06	100.06
5	ZJ170222-2^c	浙江 (Zhejiang)	4.59	2.98	2.97	0.29	100.29	0.21	0.22	0.82	99.19	0.26	0.26	0.83	99.62	8.04	8.03	0.06	100.04
6	ZJ170222-3^c	浙江 (Zhejiang)	5.12	2.43	2.43	0.36	100.36	0.25	0.25	0.71	99.30	0.32	0.33	0.67	99.46	8.12	8.12	0.06	100.10
7	ZJ161228^c	浙江 (Zhejiang)	8.58	1.07	1.06	0.78	100.79	0.33	0.33	0.54	99.47	0.60	0.61	0.38	99.44	10.58	10.57	0.04	100.09
8	SH160707^a	上海 (Shanghai)	2.42	2.37	2.37	0.36	100.37	0.25	0.26	0.69	99.32	0.39	0.39	0.56	99.62	5.44	5.44	0.09	100.06
9	SH160714^a	上海 (Shanghai)	5.51	1.56	1.56	0.54	100.55	0.32	0.32	0.55	99.45	0.61	0.61	0.38	99.24	8.00	7.99	0.06	100.08
10	ZJ160723^a	浙江 (Zhejiang)	2.82	2.64	2.63	0.33	100.33	0.15	0.15	1.17	98.84	0.28	0.28	0.77	99.87	5.89	5.89	0.08	100.01
11	ZJ170603^c	浙江 (Zhejiang)	4.59	2.03	2.03	0.10	100.10	0.21	0.21	0.16	99.84	0.52	0.52	0.13	99.68	7.36	7.35	0.01	100.03
12	ZJ150521^c	浙江 (Zhejiang)	5.58	2.32	2.32	0.20	100.20	0.30	0.30	0.30	99.71	0.38	0.38	0.32	99.69	8.58	8.58	0.03	100.03
13	ZJ170307^c	浙江 (Zhejiang)	5.47	2.43	2.43	0.19	100.19	0.35	0.35	0.25	99.75	0.38	0.38	0.31	99.66	8.64	8.63	0.03	100.06
14	JS160731-1^a	江苏 (Jiangsu)	12.23	1.16	1.15	0.73	100.73	0.33	0.33	0.53	99.47	0.48	0.49	0.46	99.70	14.20	14.19	0.03	100.05
15	JS160731-2^a	江苏 (Jiangsu)	4.05	2.44	2.43	0.35	100.36	0.21	0.21	0.83	99.18	0.69	0.70	0.34	99.45	7.39	7.39	0.06	100.06
16	JS160731-3^a	江苏 (Jiangsu)	5.47	1.58	1.58	0.54	100.54	0.21	0.22	0.81	99.19	0.40	0.40	0.55	99.63	7.67	7.67	0.06	100.03
17	JS160802^a	江苏 (Jiangsu)	13.65	1.45	1.44	0.58	100.59	0.44	0.44	0.40	99.60	0.62	0.62	0.37	99.54	16.15	16.15	0.03	100.03
18	JS160824-1^a	江苏 (Jiangsu)	12.83	1.03	1.02	0.82	100.82	0.34	0.34	0.51	99.49	0.48	0.48	0.47	99.35	14.68	14.68	0.03	100.07
19	JS160824-2^a	江苏 (Jiangsu)	4.89	1.58	1.57	0.54	100.54	0.17	0.17	1.01	99.00	0.33	0.33	0.65	99.49	6.97	6.97	0.07	100.04
20	JS160824-3^a	江苏 (Jiangsu)	8.95	1.11	1.10	0.75	100.76	0.31	0.31	0.57	99.43	0.43	0.43	0.52	99.33	10.80	10.80	0.04	100.06
21	SD160809^a	山东 (Shandong)	2.96	0.94	0.93	0.89	100.90	0.30	0.30	0.59	99.42	0.41	0.41	0.55	99.32	4.60	4.59	0.10	100.05
22	SH160904^b	上海 (Shanghai)	6.07	2.15	2.15	0.40	100.40	0.17	0.17	1.05	98.96	0.32	0.32	0.69	99.62	8.70	8.70	0.05	100.06
23	SH161215^c	上海 (Shanghai)	5.46	0.75	0.74	1.12	101.13	0.39	0.39	0.45	99.55	0.61	0.61	0.38	99.44	7.20	7.20	0.06	100.08
注(note)：注(note)：1.列参照成分(reference substance)；2.例待测成分(substance to be determined) 药材样品编号表示为：药材产地(当地生长)+采摘年份+采摘月份+采摘日期(+编号)(the Lot number of herbs sample was expressed as：habitat(grow in local area)+ year + month + date of herbs collected) (+No.) a.晒干b.烘干(炮制温度75 ℃) c.烘干(炮制温度105 ℃) [a.dry in the sun b.dry with oven(under 75 ℃) c.dry with oven(under 105 ℃)]

表 9 “一测多评”法与外标法所测30批常春藤提取物中4个皂苷含量及比较 Table 9 T Contents of the four saponins in 30 baches of H. helix extracts determined by both QAMS method and external standard method

No.	样品编号 (Lot No.)	药材产地 (herb oringin)	HDC¹	α-H²				HDB²				HDD²				4指标成分总和(total contents of 4 active ingredients)
No.	样品编号 (Lot No.)	药材产地 (herb oringin)	W_s	W_s	W_f	RE	W_s/W_f	W_s	W_f	RE	W_s/W_f	W_s	W_f	RE	W_s/W_f	W_s	W_f	RE	W_s/W_f
1	21-2	浙江 (Zhejiang)	60.33	6.09	6.06	0.39	100.39	3.44	3.45	0.14	99.86	4.16	4.16	0.18	99.82	74.02	74.00	0.02	100.02
2	22-2	浙江 (Zhejiang)	48.96	21.13	21.10	0.13	100.14	3.09	3.10	0.17	99.83	3.75	3.76	0.21	99.79	76.93	76.92	0.02	100.02
3	23-2	浙江 (Zhejiang)	66.19	1.99	1.97	1.26	101.27	3.46	3.46	0.15	99.85	4.83	4.83	0.17	99.83	76.47	76.46	0.01	100.01
4	24-2	浙江 (Zhejiang)	42.44	7.70	7.67	0.31	100.31	3.24	3.25	0.15	99.85	4.33	4.34	0.18	99.82	57.71	57.69	0.02	100.02
5	25-2	浙江 (Zhejiang)	54.73	14.99	14.97	0.18	100.18	3.12	3.12	0.16	99.84	3.94	3.95	0.19	99.81	76.78	76.77	0.02	100.02
6	FD1-3	浙江 (Zhejiang)	64.16	1.03	1.00	3.12	103.23	3.11	3.11	0.22	99.78	5.10	5.11	0.20	99.80	73.40	73.39	0.02	100.02
7	20-3	上海 (Shanghai)	54.74	15.45	15.42	0.19	100.19	3.05	3.05	0.18	99.82	6.08	6.09	0.15	99.85	79.32	79.30	0.02	100.02
8	FD1-2	上海 (Shanghai)	62.14	1.80	1.78	1.38	101.40	2.95	2.95	0.18	99.82	6.51	6.52	0.14	99.86	73.40	73.39	0.01	100.01
9	20-1	上海 (Shanghai)	62.98	0.77	0.75	3.28	103.39	3.24	3.25	0.17	99.83	7.30	7.31	0.13	99.87	74.29	74.28	0.01	100.01
10	20-4	上海 (Shanghai)	61.64	12.08	12.05	0.23	100.23	3.91	3.92	0.14	99.86	5.19	5.20	0.17	99.83	82.82	82.81	0.02	100.02
11	FD1-1	上海 (Shanghai)	60.84	1.48	1.46	1.45	101.47	3.03	3.03	0.15	99.85	8.29	8.30	0.11	99.89	73.64	73.64	0.01	100.01
12	18-3	上海 (Shanghai)	63.37	11.62	11.59	0.24	100.24	4.49	4.49	0.12	99.88	5.73	5.73	0.16	99.84	85.20	85.18	0.02	100.02
13	18-2	上海 (Shanghai)	62.29	7.19	7.16	0.35	100.35	4.26	4.27	0.12	99.88	7.82	7.83	0.12	99.88	81.56	81.55	0.01	100.01
14	24-1	浙江	61.01	1.44	1.42	1.72	101.75	3.01	3.01	0.18	99.82	5.07	5.08	0.17	99.83	70.53	70.52	0.02	100.02
15	19-4	上海 (Shanghai)	60.93	11.15	11.12	0.25	100.25	3.62	3.63	0.15	99.85	4.18	4.19	0.20	99.80	79.89	79.88	0.02	100.02
16	19-2	上海 (Shanghai)	58.65	4.13	4.11	0.55	100.56	3.03	3.04	0.16	99.84	6.32	6.32	0.13	99.87	72.12	72.11	0.01	100.01
17	19-5	上海 (Shanghai)	68.01	6.78	6.76	0.37	100.37	3.01	3.02	0.17	99.83	5.17	5.18	0.16	99.84	82.97	82.96	0.01	100.01
18	17-4	上海 (Shanghai)	65.57	7.55	7.53	0.34	100.34	4.08	4.09	0.13	99.87	8.10	8.11	0.12	99.88	85.31	85.30	0.01	100.01
19	19-3	上海 (Shanghai)	61.10	8.03	8.00	0.33	100.33	3.25	3.26	0.17	99.83	6.67	6.68	0.14	99.86	79.05	79.04	0.01	100.01
20	19-1	上海 (Shanghai)	61.76	1.18	1.15	2.13	102.17	3.13	3.14	0.17	99.83	7.09	7.10	0.13	99.87	73.16	73.15	0.01	100.01
21	20-2	上海 (Shanghai)	61.76	3.24	3.22	0.73	100.73	3.26	3.27	0.15	99.85	6.66	6.67	0.13	99.87	74.93	74.92	0.01	100.01
22	25-1	浙江 (Zhejiang)	62.43	1.20	1.18	1.96	102.00	3.14	3.15	0.16	99.84	5.31	5.32	0.16	99.84	72.08	72.07	0.01	100.01
23	18-1	上海 (Shanghai)	61.73	7.97	7.94	0.33	100.33	3.39	3.39	0.16	99.84	6.57	6.58	0.14	99.86	79.65	79.64	0.01	100.01
24	22-1	浙江 (Zhejiang)	53.12	2.05	2.03	1.13	101.14	2.78	2.78	0.18	99.82	6.53	6.53	0.13	99.87	64.47	64.46	0.01	100.01
25	21-1	浙江 (Zhejiang)	50.01	2.47	2.44	0.93	100.94	2.55	2.56	0.19	99.81	6.71	6.72	0.13	99.87	61.73	61.72	0.02	100.02
26	23-3	浙江 (Zhejiang)	62.69	4.60	4.58	0.53	100.54	3.28	3.28	0.16	99.84	4.22	4.23	0.19	99.81	74.79	74.78	0.02	100.02
27	22-3	浙江 (Zhejiang)	65.77	4.10	4.07	0.64	100.65	3.32	3.33	0.17	99.83	4.48	4.49	0.19	99.81	77.67	77.66	0.02	100.02
28	21-3	浙江 (Zhejiang)	61.59	4.67	4.64	0.55	100.55	2.98	2.99	0.18	99.82	4.18	4.19	0.19	99.81	73.41	73.40	0.02	100.02
29	FD3-1	浙江 (Zhejiang)	50.74	20.02	19.99	0.14	100.14	2.99	3.00	0.18	99.82	3.53	3.54	0.22	99.78	77.28	77.26	0.02	100.02
30	FD2-1	浙江 (Zhejiang)	50.60	21.88	21.85	0.13	100.13	3.08	3.09	0.18	99.82	3.62	3.63	0.22	99.78	79.18	79.16	0.02	100.02
注(note)：1.参照成分(reference substance)；2.待测成分(substance to be determined) QAMS法测定结果以W_f表示、外标法的测定结果以W_s表示(The determined results of QAMS method is expressed as W_f；The determined results of external reference method is expressed as W_s) 相对偏差(Relative error，RE)= $ \left\| \frac{{{\mathit{\mu }}_{\text{i}}}-{{\mathit{X}}_{\text{i}}}}{{{\mathit{X}}_{\text{i}}}} \right\|$×100%，式中X_i为外标法实测值，μ_i为QAMS法计算值，i为样品序号(Formula：X_i is the value obtained by external standard method，μ_i is the value obtained by QAMS method，i is sample number)

3 讨论

一测多评法中校正因子的计算，文献^[13-15]普遍采用多点校正、再求平均值的方法，易导致校正因子的误差较大。采用标准曲线斜率之比确定校正因子，相对多点校正更合理、准确。本研究考察了α-H、HDD、HDB 3个常春藤皂苷成分相对保留值和保留时间差在3种品牌仪器和3种品牌色谱柱中的重现性，以相对保留值作为待测成分色谱峰的定位依据。实验中发现，随着各色谱峰保留时间远离常春藤萜苷C参照峰，其相对保留时间RSD逐渐增大。由实验结果可以看出，不同品牌的C₁₈色谱柱对α-常春藤素的选择性较强，相同色谱条件下，α-常春藤素在不同色谱柱上的保留行为差异较大，RSD大于10%，而其余成分对色谱仪及色谱柱的选择性相对较弱，相对保留时间的RSD均在5%以下。考虑是由于α-H结构不同于其他3个皂苷，为单糖链皂苷，极性较弱且与不同C₁₈反相色谱柱保留能力强弱有差异所致。为保证QAMS法待测色谱峰的准确定位，可参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》规定，对试验所需色谱柱型号和规格进行规定，以期选择保留行为较为相似的C₁₈色谱柱对常春藤皂苷类成分进行质量分析。

因常春藤萜苷C价廉易得且在常春藤中含量最高，故本实验选择常春藤萜苷C为参照物质进行常春藤及其提取物中皂苷类成分的一测多评分析。α-H、HDD、HDB这3个常春藤皂苷成分在不同色谱仪、不同色谱条件下的校正因子耐用性良好(RSD＜4%)，可用于洋常春藤及其提取物的质量控制。23批洋常春藤及30批常春藤醇提取物外标法和一测多评法分析结果的差异很小，具有良好的一致性。23批药材为本课题组前期在不同产地、采摘时期及炮制温度下炮制所得(具体见表 8)，其中4个皂苷成分的含量总和在4.60%~16.15%，表明本文建立的一测多评法适用于不同产地、不同采摘期及不同炮制温度下洋常春藤及其提取物中总个皂苷的含量测定；30批常春藤醇提取物总和在57.71%~85.20%，表明药材质量及工艺条件的变化均会影响常春藤提取物中主要皂苷成分的含量，检测这4个皂苷成分可大致确定提取物中总皂苷含量。

综上，本文建立的以常春藤皂苷C为参照成分，测定洋常春藤及其提取物中α-H、HDD、HDB 3个常春藤皂苷类成分含量的一测多评方法的准确性和重复性好，快速经济，减少了样品测试中对照品及有机溶剂的消耗，为洋常春藤药材及其提取物的质量分析和质量控制提供了简便可行的方法，有重要的应用价值。

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