2018, Vol. 38 
2. 白城市食品药品检验所, 白城 137000
2. Baicheng Institute for Food and Drug Control, Baicheng 137000, China
一测多评法(quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS)是指在对中药进行多指标质量评价时，以样品中某一典型组分(有对照品供应者)为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子(relative correction factor，RCF)，通过相对校正因子计算其他组分的含量[1-2]。一测多评法自2006年提出后，成为中药药物分析领域的研究热点，越来越广泛地应用于中药材、中药饮片、提取物及中药复方制剂等的多指标成分分析[3-12]。
保心宁片为临床常用中药复方制剂，具有活血化瘀、行气止痛的功效[13]，临床上用于治疗心绞痛、心律失常，改善冠心病症状等。保心宁片由丹参、当归和枳壳等干浸膏以及三七药材粉末所制成，其中丹参为其君药，行散瘀行血之功。保心宁片现行质量标准比较简单，只有性状、鉴别、某种单一成分的含量测定及常规检查，不能全面反映其质量。为提高保心宁片的质量标准，以更好地控制保心宁片的质量，同时基于君药丹参中某些成分对光、热的不稳定性，本实验以对照品便宜易得的丹酚酸B为内标，采用一测多评法建立保心宁片中丹参类主要活性成分迷迭香酸、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量的一测多评法，并与常规外标法进行比较，分析一测多评法用于保心宁片中丹参类成分含量测定的可行性。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪；BT-125D型分析天平，德国Sartorius；DK-98ⅡA电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司。
1.2 试剂与材料对照品迷迭香酸(批号：111871-2011102，纯度99.8%)、丹酚酸B(批号：111562-201514，纯度93.7%)、二氢丹参酮Ⅰ(批号：0868-200103)、隐丹参酮(批号：110852-200806，纯度98.7%)、丹参酮Ⅰ(批号：0867-200205)、丹参酮ⅡA(批号：110766-200619)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈，色谱纯，Fisher；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。
保心宁片共8批，来自4个生产厂家，分别为通化正和药业集团股份有限公司、修正药业集团股份有限公司、四川巴中普瑞制药有限公司、湖北广仁药业有限公司，批号分别为140622、150603、150903、151202、160108、150102、151203、1605010。
2 方法与结果 2.1 色谱条件Agilent 1200高效液相色谱仪，Capcell C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料:十八烷基硅烷键合硅胶)，以乙腈-0.05%磷酸作为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱时间及比例见表 1；流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长270 nm。
|
表 1 梯度洗脱时间表 Table 1 Gradient elution schedule |
精密称取各对照品，置于25 mL量瓶中，加甲醇配制成每1 mL含迷迭香酸0.1 mg、丹酚酸B 0.1 mg、二氢丹参酮Ⅰ 0.03 mg、隐丹参酮0.02 mg、丹参酮Ⅰ 0.05 mg、丹参酮ⅡA 0.01 mg的混合溶液，作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液取本品，去除包衣后，研细，精密称定，称取1 g于具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液25 mL，精密称量，加热回流90 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
2.2.3 阴性溶液按处方比例及制备工艺，制备缺丹参的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
2.3 方法学考察在上述的色谱条件下，分别精密吸取对照品、供试品和各阴性对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果显示，阴性对照物无干扰，见图 1。
|
1.迷迭香酸(rosmarinic acid) 2.丹酚酸B(salvianolic acid B) 3.二氢丹参酮Ⅰ(dihydrotanshioneⅠ) 4.隐丹参酮(cryptotanshinone) 5.丹参酮Ⅰ(tanshinoneⅠ) 6.丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA) 图 1 对照品(A)、供试品(B)、丹参阴性对照(C)色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and sample(B)and negative sample without Salviae Miltiorrhizae(C) |
分别精密吸取对照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，注入色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别以迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量(μg)和相应的峰面积进行线性回归，计算回归方程，具体见表 2。
|
|
表 2 6种成分线性关系表 Table 2 Linear range of 6 chemical components |
取上述供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，计算峰面积。结果显示，供试品色谱峰峰面积的RSD小于3.0%，表明仪器的精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取保心宁片，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、18、24 h进样，计算各色谱峰峰面积。结果显示，各色谱峰峰面积的RSD小于3.0%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。
2.3.4 重复性试验取保心宁片6份，分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下方法测定，记录各色谱峰峰面积。结果显示，迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的平均含量分别为0.129、0.752、0.042、0.038、0.058、0.015 mg·片-1，各色谱峰峰面积的RSD小于3.0%，表明此方法的重复性良好。
2.3.5 回收率试验精密称取样品0.5 g，共6份，分别加入迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，按“2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别计算回收率。结果显示，6种成分的回收率在96.8%~99.9%之间，RSD均小于3.0%。
2.4 相对校正因子的确定 2.4.1 相对校正因子的测定采用多点校正法进行测定[14]。取“2.2”项下的对照品溶液按，“2.1”项下色谱条件进样，进样体积分别为1、2、5、10、15、20、25 μL，记录各色谱峰峰面积，按公式fk/m=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak) (式中Ak为内参物的峰面积，Wk为内参物的质量或浓度；Am为其他组分m的峰面积，Wm为其他组分m的质量或浓度)，以丹酚酸B为内参物，分别计算迷迭香酸、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的相对校正因子f，结果见表 3。
|
|
表 3 指标性成分的相对校正因子 Table 3 RCFs of the index components |
采用Agilent1260、岛津LC-20A、Waters E2695，分别考察不同高效液相色谱仪对指标性成分相对校正因子的影响，结果显示，各指标性成分间的相对校正因子重复性良好，RSD＜2.5%，说明不同仪器对相对校正因子无显著影响。
2.4.3 不同色谱柱对相对校正因子的影响采用Apollo C18色谱柱、Gemini C18色谱柱、Sepax C18色谱柱，分别考察不同色谱柱对指标性成分相对校正因子的影响，结果显示，各指标性成分间的相对校正因子重复性良好，RSD＜2.3%，说明不同色谱柱对相对校正因子无显著影响。
2.5 一测多评法(QAMS)与外标法(ESM)的比较分别采用外标法和一测多评法对8批保心宁片中6个指标性成分进行含量测定，结果见表 4。由表 4可知，常规的外标法测得的含量与一测多评法计算所得的含量经t检验后无明显差异，说明所建立的方法结果可靠。
|
|
表 4 保心宁片中6种成分含量测定结果(mg·片-1) Table 4 Determination results of 8 components in 6 Baoxinning tablets(mg·tablet-1, n=6) |
中国药典2010年版就已经收录了一测多评法[15]，本文在前期研究的基础上，采用一测多评法与传统的外标法，对保心宁片中6种丹参类活性成分进行含量测定，选取其中含量最高、对照品便宜易得的丹酚酸B作为内参物，建立与其他5种成分间的相对校正因子，进而同时测定其中6个指标性成分的含量，结果可靠，重复性好，方法简单、快速，能够在缺乏其他对照品的情况下同时对多个指标进行含量测定，较传统的外标法极大地节约了检验时间和成本，为保心宁片的质量控制提供了一种简洁方便的方法。
| [1] |
王智民, 钱忠直, 张启伟, 等. 一测多评法建立的技术指南[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(3): 657. WANG ZW, QIAN ZZ, ZHANG QW, et al. Tachnical manual of QAMS[J]. China J Chin Mater Med, 2011, 36(3): 657. |
| [2] |
王智民, 高慧敏, 付雪涛, 等. "一测多评"法中药质量评价模式方法学研究[J]. 中国中药杂志, 2011, 31(23): 1925. WANG ZW, GAO HM, FU XT, et al. Multicomponents quantitation by one marker new method for quality evaluation of Chinese herbal medicine[J]. China J Chin Mater Med, 2011, 31(23): 1925. |
| [3] |
秦增贵, 柳克浩, 高长青, 等. 一测多评法测定白花丹参中丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的含量[J]. 药学研究, 2016, 35(8): 457. QIN ZG, LIU KH, GAO CQ, et al. Determination of tanshinone ⅡA, cryptotanshinone and tanshinone Ⅰ in Salvia miltiorrhiza Bge with quantitative analysis of multi-components by single-marker[J]. China J Pharm Res, 2016, 35(8): 457. |
| [4] |
冯伟红, 李春, 吉利娜, 等. 基于高分离度和对照图谱的红参中9种人参皂苷类成分"一测多评"质量评价研究[J]. 中国中药杂志, 2016, 41(18): 3389. FENG WH, LI C, JI LN, et al. Quantitative analysis of nine ginsenosides in red ginseng using QAMS method based on high-resolution and reference chromatography of red dinsing[J]. China J Chin Mater Med, 2016, 41(18): 3389. |
| [5] |
张美玲, 蔡广知, 宋媛, 等. 基于一测多评法的人参叶药材、提取物及制剂中皂苷含量测定方法研究[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(6): 997. ZHANG ML, CAI GZ, SONG Y, et al. Study on the determination of saponins in Ginseng Folium medicinal materials, extracts and preparations by saponins QAMS[J]. Chin J Pharm Anal, 2015, 35(6): 997. |
| [6] |
汪丽君, 刘淑敏, 毛春芹, 等. 一测多评法同时测定五味子中8个木质素类成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(7): 1191. WANG LJ, LIU SM, MAO CQ, et al. Simultaneous determination of 8 lignans in Schisandra chinensis by quantitative analysis of multi-components by single marker[J]. Chin J Pharm Anal, 2015, 35(7): 1191. |
| [7] |
杨菲, 王智民, 张启伟, 等. "一测多评"法测定丹参酚酸类成分的含量[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(17): 2372. YANG F, WANG ZM, ZHANG QW, et al. A quantitative method for simultaneous assay of five ingredients with one marker in Salvia miltiorrhiza[J]. China J Chin Mater Med, 2011, 36(17): 2372. |
| [8] |
冯伟红, 王智民, 张启伟, 等. 一测多评法测定秦皮药材与饮片中香豆素类成分的含量[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(13): 1782. FENG WH, WANG ZM, ZHANG QW, et al. Quantitative method for simultaneous assay of four coumarins with one marker in Fraxinicortex[J]. China J Chin Mater Med, 2011, 36(13): 1782. |
| [9] |
胡雪艳, 李焕清, 邓红, 等. 指纹图谱与一测多评法相结合评价荔枝多酚提取物[J]. 中草药, 2017, 48(3): 490. HU XY, LI HQ, DENG H, et al. Combinational quality control method of polyphenolic extract in Litchi chinensis based on fingerprint and QAMS[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2017, 48(3): 490. |
| [10] |
陈晶晶, 周媛, 黄晓蕾, 等. 基于一测多评的舒血宁注射液定量测定方法研究[J]. 中草药, 2016, 47(11): 1890. CHEN JJ, ZHOU Y, HUANG XL, et al. Determination of content of Shuxuening injection based on quantitative analysis of multi-components by single marker[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2016, 47(11): 1890. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2016.11.013 |
| [11] |
张琳, 窦志华, 陈霞, 等. 一测多评法测定丹参合剂中5种水溶性成分的含量[J]. 中国中医药学刊, 2015, 33(12): 3006. ZHANG L, DOU ZH, CHEN X, et al. Quantitative method for simultaneous assay of five water-soluble ingredients with one marker in Danshen mixture by QAMS[J]. Chin Archi Tradit Chin Med, 2015, 33(12): 3006. |
| [12] |
梁文仪, 袁永兵, 陈文静, 等. 一测多评技术在3种丹参制剂质量控制中的可行性分析[J]. 中草药, 2016, 47(23): 4179. LIANG WY, YUANG YB, CHEN WJ, et al. Feasibility study of QAMS for quality control on three kinds of related preparations of Salvia miltiorrhiza[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2016, 47(23): 4179. |
| [13] |
卫生部药品标准. 第二册[S]. 1990: 175 Drug Specifications Promulgated by the Ministry of Public Health. P R China. Vol 2[S]. 1990: 175 |
| [14] |
李倩, 刘伟, 罗祖良, 等. 一测多评法测定丹参中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和二氢丹参酮Ⅰ的含量[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(6): 824. LI Q, LIU W, LUO ZL, et al. Simultaneous determination of four tanshinones in Salvia miltiorrhiza by QAMS[J]. China J Chin Mater Med, 2012, 37(6): 824. |
| [15] |
《中华人民共和国药典》2010年版. 一部[S]. 2010: 285 ChP 2010. VolⅠ[S]. 2010: 285 |