2018, Vol. 38 
2. 中国中医科学院 中药资源中心 重庆分中心, 重庆 400065;
3. 西南大学 药学院, 重庆 400716
2. Chongqing Sub-center of National Resources Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Chongqing 400065, China;
3. College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400716, China
独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根，始载于《神农本草经》，列为上品[1]，具有祛风除湿，通痹止痛的作用。现代药理研究表明，独活不仅具有抗炎、镇痛、解痉等[2]与其“通痹止痛”功效相关的作用，还具有催眠、抗肿瘤以及防止阿尔茨海默病的作用[3-6]。独活中主要成分为香豆素类和挥发油类[7-8]。重庆、鄂西是独活的道地产区，其来源主要为栽培品，市场上称为川独活[9]。该地区建立了许多独活药材种植基地，为保证独活的药材质量，有必要对该地区的独活质量进行评价。
指纹图谱作为一种多组分复杂样品的有效质量控制方法，能够反映出待测样品的整体性、特征性[10]，结合同时测定多种成分的含量，被广泛应用于中药材和中成药的质量研究中[11-13]。目前，已有独活挥发性成分指纹图谱技术[14]及红外指纹图谱技术[15]的研究报道。关于独活HPLC指纹图谱虽有人做过研究，但各峰分离情况较差，且未匹配共有峰[16]。本研究建立了独活的HPLC指纹图谱方法，各共有峰分离度均较好，并以4个香豆素类成分为对照，对18批独活进行含量测定，为更加全面地评价独活质量建立了方法参考依据。
1 仪器、试药及样品 1.1 仪器Agilent 1 260高效液相色谱仪(美国Agilent公司，DAD检测器)，SWELL ChromplusTM C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，SWELL公司)；Milli-Q Integral 5型纯水仪(美国Millipoer公司)；BSA 124-S型电子天平(德国Sartorius)；SB-4200 DTD型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。SWELL ChromplusTM C18色谱柱(填料：十八烷基硅烷键合硅胶；250 mm×4.6 mm，5 μm；安捷伦公司)。
1.2 试药乙腈(美国TEDIA，色谱纯)，醋酸(美国TEDIA，色谱纯)，甲醇(广东华光科技股份有限公司，分析纯)，乙醇(重庆川东化工有限公司，分析纯)。对照品蛇床子素(批号MUST-16012417)、二氢欧山芹醇当归酸酯(批号MUST-16022403)、异欧前胡素(批号MUSY-16032410)购自成都曼斯特生物科技有限公司，二氢欧山芹醇(批号Z08A7S12651)购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均达到98%以上。独活对照药材(ID：5US4-V6CK)购自中国食品药品检定研究院。
1.3 样品独活样品于2015年10~11月份在重庆巫溪、巫山、奉节、开县、城口以及湖北宜昌等地采集或购自成都荷花池药材市场，共收集18批样品，经重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根。
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表 1 独活样品来源 Table 1 Origin of Angelica Pubescens Radix |
精密称取干燥独活粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，称定质量，25 ℃超声处理(功率400 W，频率40 kHz)20 min，冷却，用甲醇补足失重，0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。
2.2 混合对照品溶液精密称取对照品蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、二氢欧山芹醇、异欧前胡素适量，加甲醇溶解，制成各对照品溶液。分别量取各对照品溶液适量，加甲醇定容，摇匀，即得蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、二氢欧山芹醇、异欧前胡素质量浓度分别为552、150、36、22μg·mL-1的混合对照品溶液。再稀释得到梯度浓度的混合对照品溶液。
3 色谱条件SWELL ChromplusTM C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%醋酸水溶液(B)，梯度洗脱(0~5 min，15% → 20%A；5~20 min，20% → 27%A；20~45 min，27%A；45~55 min，27% → 30%A；55~56 min，30% → 41%A；56~60 min，41%A；60~70 min，41% → 50%A；70~90 min，50% → 55%A；90~95 min，55% → 15%A；95~100 min，15%A)；流速1.0 mL·min-1，检测波长325 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。
4 指纹图谱 4.1 方法学考察 4.1.1 稳定性取同一供试品溶液，按“3”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图。以蛇床子素(19)为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间RSD＜1%、相对峰面积RSD＜5%，相似度均在0.995以上，表明供试品溶液于24 h内测定结果稳定。
4.1.2 精密度取同一供试品溶液，按“3”项下色谱条件连续测定6次，记录色谱图。以蛇床子素(19)为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间RSD＜1%、相对峰面积RSD＜5%，相似度均在0.998以上，表明仪器精密度良好。
4.1.3 重复性取同一来源独活样品，按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，记录色谱图。以蛇床子素(19)为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间RSD＜0.6%、相对峰面积RSD＜5%，相似度均在0.999以上，表明本方法重复性良好。
4.2 不同产地独活指纹图谱的建立取独活样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件依次进样检测，记录色谱图。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版本”软件进行分析，设定独活对照药材(DZYC)色谱图为参照图谱，选择多点校正进行匹配。18批不同来源独活指纹图谱见图 1，将其他图谱与参照图谱自动匹配后生成对照特征图谱(图 2)。各批样品与对照图谱的相似度分别为0.952、0.902、0.981、0.966、0.978、0.967、0.966、0.968、0.974、0.987、0.932、0.904、0.995、0.919、0.854、0.959、0.950、0.952、0.968。除ES-2相似度值为0.854外，其余均大于0.900，表明相似度良好。
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图 1 18批独活HPLC指纹图谱 Figure 1 HPLC fingerprints of 18 batches of Angelica Pubescens Radix |
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1~21.样品和对照药材共有峰(common peaks of samples and reference) 图 2 独活对照特征图谱(19-蛇床子素) Figure 2 HPLC chromatogram of reference characteristic of Angelica Pubescens Radix(19-osthole) |
根据18批独活的指纹图谱匹配结果，共匹配成功21个共有指纹峰。经过与对照品对比标定出4个色谱峰，分别为9号(二氢欧山芹醇)、19号(蛇床子素)、20号(异欧前胡素)、21号(二氢欧山芹醇当归酸酯)。
4.3 聚类分析以18批样品和对照药材中21个共有峰的峰面积为变量，利用SPSS 20.0软件中“系统聚类”方法对独活样品HPLC指纹图谱进行聚类分析，以余弦作为度量标准，结果见图 3。18份样品和对照品共聚为3大类：宜昌、城口四合、城口龙盘、平利、开县、巫山、巫溪新田、城口双利和对照药材被聚为第Ⅰ类；巫溪双阳、巫溪梓树、奉节、城口黄连洞、城口仓坪、城口松柏、恩施-3、巫溪新月、恩施-1聚为第Ⅱ类；恩施-2单独聚为第Ⅲ类。分析结果可以看出，独活指纹图谱共有峰聚类与产地无明确相关性，说明在该区域范围内，地理位置不是影响其品质的主要因素。
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图 3 特征图谱聚类分析 Figure 3 Hierarchical clustering analysis of characteristic chromatograms |
取混合对照品溶液、供试品溶液，按“3”项下色谱条件进样检测，二氢欧山芹醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯与其相邻色谱峰的分离度均＞1.5，理论塔板数以各色谱峰计均在5万以上。混合对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图 4。
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1.二氢欧山芹醇(columbianetin) 2.蛇床子素(osthole) 3.异欧前胡素(isoimperatorin) 4.二氢欧山芹醇当归酸酯(columbianadin) 图 4 混合对照品(A)和独活样品(B)的HPLC图 Figure 4 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A) and Angelica Pubescens Radix(B) |
将梯度浓度的混合对照品溶液按“3”项下色谱条件进样检测。以各对照品峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，做标准曲线，得到回归方程。以信噪比为3时考察检测下限、信噪比为10时考察定量下限，结果见表 2。
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表 2 回归方程、线性范围及检测下限、定量下限 Table 2 Regression equation, linear range, LOD and LOQ |
取同一混合对照品溶液按“3”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分的峰面积。结果二氢欧山芹醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积RSD分别为0.97%、0.91%、1.1%、0.89%，表明仪器精密度良好。
5.4 重复性试验取同一来源独活样品，按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，记录各成分的峰面积。结果二氢欧山芹醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积RSD分别为0.51%、1.0%、1.1%、0.95%，表明本方法重现性良好。
5.5 稳定性试验取同一供试品溶液，按“3”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样，记录各成分的峰面积。结果二氢欧山芹醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积RSD分别为1.1%、0.71%、0.51%、3.2%，表明供试品溶液于24 h内测定结果稳定。
5.6 回收率试验精密称取已知含量的同一来源独活样品6份，每份0.25 g，分别精密添加与样品中含量相当的二氢欧山芹醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件进样检测，计算各成分的平均加样回收率。结果见表 3，表明本方法的回收率良好。
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表 3 回收率实验结果(n=3) Table 3 Results of recovery tests |
按“2.1”项下方法每个样品平行制备3份供试品溶液，按“3”项下色谱条件进样检测，记录色谱图，将二氢欧山芹醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯的峰面积代入线性方程，计算其百分含量，结果见表 4。
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表 4 独活中4个成分含量测定结果(X±SD) Table 4 Determination results of 4 components in Angelica Pubescens Radix |
利用SPSS软件中“描述性分析”对独活中4个香豆素类成分含量结果进行分析。结果见表 5、图 5。
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表 5 独活中4个香豆素类成分含量统计表 Table 5 The table of the content of the four kinds of coumarin of Angelica Pubescens Radix |
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图 5 独活中4个香豆素类成分的含量范围 Figure 5 The range of the content of four kinds of coumarin of Angelica Pubescens Radix |
本实验通过全波长扫描发现，独活醇提物中绝大多数成分的吸收峰在325 nm处，故选择在325 nm处检测独活的指纹图谱。考察了乙腈-水、乙腈-0.2%醋酸水溶液不同洗脱程序对色谱峰分离效果的影响，最终确定以乙腈-0.2%醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。此外，考察了不同体积分数(100%、80%、60%、40%、20%)甲醇和乙醇对独活指纹图谱的影响。结果发现不同体积分数的甲醇或乙醇溶液检出的色谱峰在数量上没有明显差异；在峰高方面，60%甲醇水提取液的色谱图中在前4 min有3个峰要明显高于其他提取液的。但由于出峰时间过早，极易受到一些不被吸附成分的干扰，峰面积不稳定，不适合作特征峰，结合制样的难易，最终选择以100%甲醇作为提取溶剂。
6.2 香豆素类成分的含量由表 5和图 5可见，除ES-3批样品中异欧前胡素含量为异常值外，其他批样品各成分均无异常值。不同产地独活中二氢欧山芹醇和异欧前胡素的含量较稳定，而2015年版《中华人民共和国药典》中有限度规定的蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯2个成分[17]的含量差异则较大，大多数药材中两者的含量远远高于中国药典最低标准。为保证独活用药安全，在制定两者含量下限的同时还需对上限做出要求。
6.3 相似度与聚类分析与对照特征图谱相比，连同对照药材在内的19批样品中，除ES-2批样品的相似度值为0.854外，其余均大于0.900，表明各产地独活醇提物中化学成分无明显差别。
聚类分析将19批样品分为3类，其中ES-2批样品被单独归为一类，与相似度分析结果一致。这可能是在药材的种植、采收、初加工等过程中存在差异导致的。
分类结果表明药材品质与产地无明显关系，加上含量测定结果整体高于《中华人民共和国药典》最低标准近一倍，说明重庆、鄂西、陕西地区均适宜独活的种植，且该区所产独活品质优良。但可能由于种植技术、采收时间以及初加工方法等因素的差异，致使该区域所产的独活在4个香豆素类成分含量上还存在较大差异，从而影响到了药材质量的稳定性。因此，应当推广规范化种植技术、统一采收时间，并进行标准化初加工，建立独活药材GAP基地，从而保障独活药材的优质、稳定、可控。
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