2018, Vol. 38 
2. 新疆医科大学中心实验室, 乌鲁木齐 830011;
3. 新疆医科大学药学院, 乌鲁木齐 830011
2. Centralab of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China;
3. College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
大蒜是多年生百合科葱属植物蒜(Allium sativum L.)的地下鳞茎，是一种历史悠久的药食两用植物[1-2]。大蒜中的生物活性成分主要是蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜，S-allyl-L-cysteine sulfoxide，alliin)和蒜酶(alliinase)。蒜氨酸是大蒜中含量最丰富的有机硫化物，存在于大蒜细胞质中[3]。蒜酶，又名蒜氨酸裂合酶、C-S裂合酶，是二聚体糖蛋白，亚单位由448个氨基酸组成，主要存在于大蒜组织液泡中，系统编号为EC 4.4.1.4[4]，相对分子质量为52~54 kDa[5]。蒜酶是大蒜及其制剂抗真菌及抑制肿瘤必不可少的前体或组成药物[6-7]。大蒜经捣碎后，蒜酶与蒜氨酸发生作用产生大蒜辣素(allicin)[8]。大蒜中除了含有蒜酶，还含有凝集素(Allium sativum L. lectin)等其他多种蛋白质[9]。植物凝集素来源于植物的一类能沉淀单糖的非免疫来源的非酶蛋白质[10]，具有凝集血细胞[11]的生物学活性，并且在植物的自身生长过程中还具有抗昆虫[12]、抑制病菌[13]等多种生物学活性，大蒜凝集素亚基相对分子质量为11.5~12.5 kDa[9, 14]。
蒜酶与蒜氨酸反应生成的大蒜辣素具有抗肿瘤活性，大蒜凝集素具有抗病毒活性，提取大蒜中的蒜酶和凝集素，有望为开发新的抗肿瘤或抗病菌药物提供原料药。生物活性成分的含量高低是评价大蒜药材质量的主要指标。有关大蒜药材中蒜氨酸及潜在大蒜辣素的含量测定已有报道，主要采用高效液相色谱法[15-16]，但有关大蒜药材中蒜酶及凝集素的同时测定鲜有报道。此外，不同产地大蒜药材中蒜氨酸及潜在大蒜辣素的含量均有差异[5, 17]，但是不同产地大蒜中的蒜酶和凝集素相对含量是否具有差异未见报道。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)作为一种经典的蛋白质分离技术，已准确测定了蒜酶提取物的相对分子质量和相对含量[18]，具有操作简便，样品用量少等优点。目前，采用SDS-PAGE比较分析不同产地大蒜药材中蒜酶与凝集素的相对含量未见报道。鲜蒜经冷冻干燥制成的大蒜冻干粉，可以保留除水分以外的所有活性成分，比鲜蒜更易储存，因此，本研究以大蒜冻干粉为研究对象，采用SDS-PAGE建立了同时测定不同产地大蒜药材中蒜酶及凝集素相对含量的方法，旨在为科学评价和有效利用大蒜药材资源提供科学依据。
1 实验部分 1.1 仪器与试剂垂直电泳仪(美国伯乐Bio-rad，GelDocXR)；凝胶扫描仪(美国伯乐Bio-rad)。
30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液(Arc-Bis，美国Sigma公司)；彩色预染标准蛋白marker(相对分子质量范围10-170 kDa，美国Sigma)；TEMED(美国Sigma公司)；甘油(天津市盛奥化学试剂有限公司)；β-巯基乙醇(天津市福晨化学试剂厂)；考马斯亮蓝R-250(Sigma公司)；甘氨酸(Sigma公司)；SDS(上海试四赫维化工有限公司)；三羟甲基氨基甲烷(Sigma公司)；溴酚蓝(Sigma公司)；磷酸盐缓冲液(天津市福晨化学试剂厂)。
1.2 样品大蒜样品信息见表 1。蒜酶纯化样品由新疆埃乐欣药业有限公司提供，批号(20091001)。
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表 1 不同产地大蒜样品信息 Table 1 Information of garlic samples from different origins |
1 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH 6.8)1.25 mL，甘油2.5 mL，SDS 0.5 g，溴酚蓝25 mg，加水至5 mL，于室温保存，使用前加入β-巯基乙醇250 μL。
1.3.2 供试品溶液鲜蒜经冷冻干燥，粉碎，过120目筛，制成大蒜冻干粉。精密称取大蒜冻干粉280 mg加入超纯水10 mL，4 000 r·min-1涡旋1min溶解，静置10 min，取上清液。将上清液300 μL与载样缓冲液100 μL混匀，100 ℃水浴加热5 min，在12 000 r·min-1离心5 min，弃沉淀，取上清液备用。
1.4 凝胶电泳操作采用不连续体系垂直板电泳进行分析，配制12%分离胶与5%浓缩胶，凝胶厚度为1 mm。在泳道中分别加入大蒜冻干粉供试品溶液10 μL、marker 5 μL开始电泳。电泳时浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为100 V，当溴酚蓝迁移出凝胶时停止电泳。电泳结束后取出胶片，考马斯亮蓝快速染色法进行凝胶染色，染色后的凝胶用BIO-RAD扫描仪进行扫描，重复3次，Gel-pro Analyzer软件进行图像分析。
2 结果与讨论 2.1 溶媒的考察称取大蒜冻干粉280 mg，分别加入磷酸盐缓冲溶液(溶媒A)和超纯水(溶媒B)各10 mL，4 000 r·min-1涡旋1 min溶解，静置10 min，吸取上清液300 μL，与载样缓冲液100 μL混匀，100 ℃水浴加热5 min，在12 000 r·min-1离心5 min，弃沉淀，取上清液10 μL进行凝胶电泳操作，考察2种溶媒溶解样品对凝胶电泳的影响。
结果如图 1所示，通过对比marker以及参考文献报道的蒜酶相对分子质量，可知约55 kDa处的蛋白条带为蒜酶。与溶媒B相比，通过溶媒A获得的蛋白条带，随着蛋白相对分子质量减小，蛋白条带越来越宽，且分散不集中，最终确定选用操作便捷、更为经济、更便于分析的超纯水作为溶解大蒜冻干粉的溶媒。
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A.磷酸盐缓冲溶液溶解样品(sample dissolved with phosphate buffer solution) B.超纯水溶解样品(sample dissolved with ultra-pure water) M. marker 图 1 不同溶媒方法获得的大蒜凝胶电泳图谱 Figure 1 The maps of PAGE obtained from different solvent methods |
称取大蒜冻干粉280 mg，用10 mL超纯水4 000 r·min-1涡旋1 min溶解，分别采用3种样品前处理方法(静置10、20、30、40、50 min；8 000 r·min-1离心5、10、15、20、25、30 min；0.22、0.45、0.80 μm微孔滤膜过滤)，对大蒜冻干粉供试品溶液的样品前处理方式进行考察。
分别取通过上述3种前处理方法得到的供试品溶液300 μL，与载样缓冲液100 μL混匀，100℃水浴加热5 min，在12 000 r·min-1离心5 min，弃沉淀，取上清液10 μL进行凝胶电泳操作。结果如图 2所示，3种前处理操作下均能清晰显示大蒜中的蛋白质，且分离效果较好。静置10 min比离心、微孔滤膜过滤操作简单，所以选择静置10 min的前处理方法。
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J1~J5.静置(stationary)10、20、30、40、50 min L1~L6. 8 000 r·min-1离心(centrifugation)5、10、15、20、25、30 min G0~G2. 0.22、0.45、0.80 μm微孔滤膜过滤(filtration with microfiltration Membrane，respectively) M. marker 图 2 3种不同样品前处理方法获得的大蒜凝胶电泳图谱 Figure 2 The maps of PAGE obtained from three different sample pretreatment methods |
分别称取大蒜冻干粉260、270、280、290、300 mg，用10 mL超纯水4 000 r·min-1涡旋1 min溶解，静置10 min，配制成质量浓度分别为26、27、28、29、30 mg·mL-1的大蒜冻干粉供试品溶液。
吸取供试品溶液上清液300 μL，与载样缓冲液100 μL混匀，100 ℃水浴加热5 min，在12 000 r·min-1离心5 min，弃沉淀，取上清液10 μL进行凝胶电泳操作。
结果如图 3所示，C1、C2条带清晰度有所欠缺，与背景的区分度不够，而C4、C5条带颜色过深，也不利于观察，C3显示蛋白条带较为完整，且分离效果好，与背景区分度恰当，利于观察，最终确定大蒜冻干粉供试品溶液浓度为28 mg·mL-1。
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C1. 26 mg·mL-1 C2. 27 mg·mL-1 C3. 28 mg·mL-1 C4. 29 mg·mL-1 C5. 30mg·mL-1 M. marker 图 3 不同浓度大蒜供试品溶液获得的凝胶电泳图谱 Figure 3 The maps of PAGE obtained from garlic sample solutions with different concentrations |
分别取纯化蒜酶、大蒜，按照“1.3.2”项下方法配制供试品溶液，制备凝胶进行电泳。扫描脱色后的凝胶得不同产地大蒜的凝胶电泳图谱，如图 4。
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S.纯化蒜酶(purified alliinase) 1~10.不同产地的大蒜样品(garlic samples from different origins) M. marker 图 4 不同产地大蒜获得的凝胶电泳图谱 Figure 4 The map of PAGE obtained from garlic samples of different origins |
结果如图 4所示，通过对比marker和参考文献报道的蒜酶相对分子质量，不同产地大蒜冻干粉中蒜酶条带的位置与纯化蒜酶位置一致，均在相对分子质量接近55 kDa处显示。通过对比marker和参考文献报道的凝集素相对分子质量，凝集素条带应在10~15 kDa显示，由此判断位于10~15 kDa的条带为凝集素。
2.5 大蒜药材样品中蒜酶、凝集素的相对含量及相对分子质量计算将不同产地大蒜凝胶电泳图谱导入Gel-pro Analyzer软件，测定样品中每个条带的峰面积，单个条带峰面积比所有条带峰面积，可得到每个条带的相对百分含量。分析不同产地的大蒜中蒜酶、凝集素。记录数据，同时以相对含量柱状图比较不同产地的差异。
以marker的比移值为横坐标，相对分子质量的对数(lgM)为纵坐标建立标准曲线，得标准曲线方程：
| $ {\rm lg} M=-1.369X+2.185 \ \ \ \ r=0.966 \ 6 $ |
将不同蛋白条带的比移值代入标准曲线方程，可得到各蛋白条带的相对分子质量，记录数据。
结果如表 2所示，纯化蒜酶和不同产地大蒜中的蒜酶相对分子质量为52.1~54.0 kDa，与文献报道的蒜酶亚基相对分子质量一致。不同产地大蒜中蒜酶相对含量在5.60%~27.1%。凝集素的相对分子质量为11.0~11.8 kDa，相对含量在12.50%~68.2%。纯化蒜酶相对含量为37.4%。
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表 2 不同产地大蒜中蒜酶、凝集素条带信息 Table 2 The band information of alliinase, lectin in garlic from different origins |
结果如表 2与图 5显示，不同产地大蒜中蒜酶与凝集素相对总含量在18.1%~77.2%，大部分都超过50%，说明蒜酶和凝集素是大蒜中的主要蛋白质。除7号新疆巴里坤大蒜样品的蒜酶相对含量略高于凝集素以外，其他各产地大蒜中凝集素的相对含量均是蒜酶相对含量的2倍以上。经过纯化的蒜酶相对含量为37.4%，凝集素相对含量为17.7%，蒜酶相对含量是凝集素含量的2倍，且蒜酶相对含量均比各产地大蒜中的蒜酶相对含量高，说明纯化蒜酶与蒜粉相比已经达到初步纯化的目的。
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S.纯化蒜酶(purified alliinase) 图 5 大蒜中蒜酶、凝集素相对含量 Figure 5 The relative content of alliinase, lectin in the garlic |
通过考察溶媒方法、样品前处理方法、供试品溶液浓度等因素，建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法同时测定不同产地大蒜中蒜酶、凝集素相对分子质量和相对含量的方法。结果可知，新疆阿克苏拜城县大蒜样品的凝集素相对含量最高，可通过采集该地区的大蒜大量获取凝集素。新疆巴里坤地区大蒜样品中蒜酶相对含量最高，可考虑采用该地区的大蒜作为原料药，研发以蒜酶作为载体的抗肿瘤药物。
由于不同地区环境气候和采收期的差异，不同产地大蒜中蒜酶和凝集素相对含量均有不同，但是大部分地区的凝集素相对含量普遍高于蒜酶相对含量。不同产地大蒜中蒜酶与凝集素相对总含量均达50%以上，证明蒜酶和凝集素是大蒜中的主要蛋白质。
课题组对不同产地大蒜药材中的蒜氨酸进行了含量测定(另文待发)。其中，新疆巴里坤大蒜样品(以干品计)的蒜氨酸含量为2.50%，仅为各产地大蒜蒜氨酸含量的均值，但蒜酶相对含量却最高；甘肃酒泉大蒜样品(以干品计)的蒜氨酸含量最高，而蒜酶相对含量居中。初步表明大蒜中的蒜酶与蒜氨酸相对含量的相关性并不显著。
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