2018, Vol. 38 
2. 西南医科大学药学院, 泸州 646000;
3. 四川省中西医结合医院, 成都 610041
2. School of Pharmacy of Southwest Medical University, Luzhou 646000, China;
3. Sichuan Intergrative Medicine Hospital, Sichuan 610041, China
附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，性辛、甘、大热，有毒，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效[1]。附子主要的活性成分为生物碱，临床上主要用于治疗风湿性关节炎、心血管系统疾病[2]。附子二萜生物碱根据C4位与C8位有无酯基，可分为双酯型生物碱、单酯型生物碱和原碱(又称胺醇型生物碱)[3]，原碱及其他易溶于水的含氮有机化合物统称为水溶性生物碱。文献曾报道附子强心有效成分为dl-去甲乌药碱[3]、氯化棍掌碱[4]、去甲猪毛菜碱[5]、尿嘧啶[6]和附子苷[7]，但含量甚微。近年来，进一步研究表明附子水溶性二萜生物碱为强心活性成分[8-9]，其中北乌宁、新乌头原碱、多根乌头碱、乌头原碱、异塔拉定、次乌宁和3-去氧乌头原碱[10]、附子灵、尼奥灵[11]、塔拉萨敏[12]等具有强心作用，同时尼奥灵具有显著的镇痛作用[13]，宋果灵具有抗炎镇痛、抗焦虑等作用[14-15]，附子灵具有抗休克，改善心肌缺血等作用[16]。此外，附子水溶性生物碱还具有抗心律失常和降压作用[17-18]，具有广阔的新药开发应用前景。
目前，一般采用HPLC-UV法测定酯型生物碱含量作为附子饮片及其加工品(中成药、提取物)的质量评价指标，鲜见测定水溶性二萜生物碱的含量，缺乏质量控制的整体性和科学性。在附子水溶性生物碱(原碱)含量测定方面，有文献报道采用UPLC-MS/MS法[19-21]同时测定多种附子水溶性生物碱(原碱)成分的含量和采用HPLC-UV法[22-23]测定宋果灵的含量，但前者设备条件要求高，普适性差，后者原碱紫外吸收弱，灵敏度差，干扰大，故本实验采用HPLC-ELSD法同时测定附子水溶性生物碱提取物和蒸附片中新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、宋果灵的含量，为附子提取物和蒸附片的质量控制提供一种简便可行的分析方法。
1 仪器与试药Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 1260 Infinity蒸发光散射检测器(Agilent公司)；MES205DU型十万分之一分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；Milli-Q Integral 3型超纯水机(Millipore公司)；KQ-300超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。Extend C18色谱柱(填料为十八烷基硅烷键合硅胶；250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent公司)。
蒸附片购于四川江油中坝附子科技发展有限公司，由四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品；附子水溶性生物碱提取物(自制，批号为20161208、20161211、20161220)；新乌头原碱(批号MUST-17021604)、次乌头原碱(批号MUST-17013005)、附子灵(批号MUST-16032804)、尼奥灵(批号MUST-16052503)、宋果灵(批号MUST-16032515)购自成都曼思特生物科技有限公司，质量分数均≥98%；乙腈、甲醇(Fisher公司)及三乙胺(成都市科龙化工试剂厂)为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 附子水溶性生物碱提取物的制备[24]取蒸附片500 g，加10倍量pH 3.5的酸水煎煮3次，每次2 h，煎煮过程中用pH计动态监测水煎液的pH值，加浓盐酸调节并维持约pH 3.5；合并3次水煎液，冷却，用20% NaOH溶液调pH 10.0，加热水解2 h，冷却，8 000 r·min-1离心8 min，取上清液用20% NaOH溶液调pH 11.0，上200 mL HPD 300大孔树脂，6 BV水洗除杂后，80%乙醇4 BV洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩、干燥，即得附子水溶性生物碱提取物。
2.2 色谱条件及系统适用性试验色谱柱：Agilent Extend C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%(体积分数)三乙胺(B)，梯度洗脱(0~8 min，10%A→20%A；8~15 min，20%A→25%A；15~25 min，25%A→25%A；25~30 min，25%A→28%A；30~31 min，28%A→ 60%A；31~42 min，60%A→65%A)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测器：蒸发光散射检测器，以氮气为载气，蒸发温度50 ℃，载气流速1.5 L·min-1，增益为1；进样量20~60 μL。在上述色谱条件下，样品中新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、宋果灵峰的保留时间与对照品一致，5种成分的色谱峰分离度良好，样品中其他成分对待测成分的测定无干扰。混合对照品、附子水溶性生物碱提取物及蒸附片的HPLC图见图 1。
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1.新乌头原碱(mesaconine) 2.次乌头原碱(hypaconine) 3.附子灵(fuziline) 4.尼奥灵(neoline) 5.宋果灵(songorine) 图 1 对照品(A)、提取物(B)及蒸附片(C)HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A), extracts(B)and Aconiti Lateralis Radix Praeparata slice(C) |
取各对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液制成每1 mL含新乌头原碱、尼奥灵0.5 mg，附子灵、次乌头原碱0.3 mg，宋果灵0.15 mg的混合对照品储备液。
2.4 供试品溶液的制备 2.4.1 提取物供试品溶液取附子水溶性生物碱提取物约50 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加入50%甲醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4.2 蒸附片供试品溶液[25]取蒸附片粉末约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.05 mol·L-1盐酸溶液50 mL，摇匀，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，摇匀，于8 000 r·min-1离心6 min，精密量取上清液25 mL，60 ℃下减压回收至约1~2 mL，转移至5 mL量瓶中，加水洗涤定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.5 线性与范围、检测下限与定量下限分别精密吸取“2.3”项下混合对照品储备液1、2、4、6、8、10 mL，分别置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。吸取上述混合对照品溶液20 μL，按“2.2”项下色谱条件测定色谱峰面积。以峰面积的对数值(Y)为纵坐标，对照品进样量的对数值(X)为横坐标，进行线性回归分析，计算回归方程和相关系数，将混合对照品溶液逐步稀释后进样测定，以色谱图中信噪比S/N为3：1和S/N为10：1确定检测下限和定量下限，结果见表 1。
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表 1 5种生物碱的线性与范围、检测下限与定量下限 Table 1 Regression equations, linear ranges, LODs and LOQs of five alkaloids |
精密吸取同一浓度的混合对照品溶液20 μL，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示，新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、宋果灵的RSD分别为1.4%、1.3%、1.9%、2.3%、1.2%，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验取供试品溶液(样品批号20161208)，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样20 μL，按“2.2”项下色谱条件分析，新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、宋果灵峰面积的RSD分别为1.0%、1.6%、1.7%、0.93%、1.9%，结果表明供试品溶液室温放置12 h内稳定。
2.8 重复性试验取同一批样品(批号20161208)6份，精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分析，测得新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、宋果灵含量的平均值(n=6)分别为47.94、25.65、20.92、46.32、15.44 mg·g-1，计算其RSD分别为0.72%、1.4%、1.7%、0.79%、1.4%，表明该方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验精密称取含量已知的同一批样品(批号20161208)6份，每份25 mg，精密加入混合对照品溶液适量，按照“2.4”项下方法制备供试溶液，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，计算5种生物碱的平均回收率及RSD，结果见表 2。
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表 2 加样回收试验结果(n=6) Table 2 Results of recovery test |
分别取3批附子水溶性生物碱提取物和3批蒸附片，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，每个样品平行2份，并按照“2.2”项下的色谱条件进行测定，计算各批样品中5种生物碱的含量，含量测定结果见表 3。
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表 3 3批提取物和3批蒸附片中5种生物碱的含量(n=2) Table 3 The contents of five alkaloids in three batches of extracts and three batches of Zhengfu tablets |
附子水溶性生物碱提取物中含量较高的主要原碱为新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、宋果灵，该类原碱成分中除宋果灵以外，均无共轭基团，紫外吸收弱且为末端吸收，基线不稳，背景干扰严重，紫外检测器无法满足HPLC分析要求，而蒸发光散射检测器是一种质量型检测器，适用于无紫外吸成分的定量定性分析，且基线平稳，灵敏度较高，故选择蒸发光散射检测器。
3.2 色谱条件的选择本实验比较了甲醇-0.1%三乙胺水溶液和乙腈-0.1%三乙胺水溶液2种流动相系统的梯度洗脱条件。以甲醇-0.1%三乙胺水溶液为流动相，改变流动相梯度难以实现尼奥灵色谱峰的基线分离，且分析时间较长。以乙腈-0.1%三乙胺水溶液为流动相，基线噪音小，5种生物碱色谱峰峰形和分离度最佳，且分析时间较短，保留时间适中，故选乙腈-0.1%三乙胺水溶液为流动相。在ELSD的参数选择上，考察了雾化温度40~60 ℃，蒸发温度40~80 ℃，载气流速1.2~2.0 L·min-1时5种生物碱的响应值，结果表明当雾化温度为40 ℃，蒸发温度为50 ℃，载气流速为1.5 L·min-1时，基线噪音小，5种生物碱的响应值最高。
3.3 小结采用本实验建立的HPLC-ELSD方法，对3批附子水溶性生物碱提取物和相应的3批蒸附片中的5种主要生物碱进行含量测定；结果表明，蒸附片中新乌头原碱、次乌头原碱含量很低，但蒸附片水煎液经水解纯化得到的水溶性生物碱提取物中新乌头原碱、次乌头原碱含量(以药材计)显著增加，而尼奥灵、附子灵、宋果灵的含量(以药材计)则无明显变化，进一步验证了酯型生物碱的水解转化规律。3批提取物中尼奥灵、附子灵、宋果灵的转移率分别在92%~95%、93%~96%、89%~93%之间，且5种生物碱的含量相差不大，提示该提取物生产工艺稳定可行。所建立的HPLC-ELSD含量测定方法操作简便，重现性好，多指标成分检测可用于蒸附子、炒附子及其生物碱提取物的全面质量控制，具有参考和应用价值。
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