2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
逆流色谱技术现已广泛应用于天然产物、保健品、地质、农业、环境、材料、化工、海洋生物等领域样品的分离纯化[1-2]。pH区带精制逆流色谱是从普通逆流色谱分离过程中发展来的一种适用于有机酸/碱化合物分离的制备色谱[3-4]，具有进样量大(达到克级)、分离纯度高、分离时间短等优点[5]。严格意义上讲，pH区带精制逆流色谱只是普通逆流色谱多种洗脱模式中的一种分离操作模式[6]。pH区带精制逆流色谱分离原理主要是依据分离物质的解离常数(pKa)和疏水性的差异而实现分离，因此分离物质包括有机酸碱衍生物、多肽类、有机染料、生物碱、吲哚素、同分异构体、儿茶酚胺和游离肽等[7-9]。由于该技术能够依据pH检测，因此也特别适用于无紫外吸收离子型化合物的分离检测。pH区带逆流色谱分离条件最为关键的是两相溶剂体系和保留酸(碱)/洗脱碱(酸)的选择，有机相中需添加有机酸或碱，水相中需添加无机反离子。如图 1，以酸性溶质RCOOH为例说明pH区带精制逆流色谱的分离机制：当酸性溶质溶解于流动相低pH区域时，被质子化而移动至有机固定相中，由于保留酸随着流动相往前推，质子化溶质随即暴露到高pH区域，使得酸性溶质被去质子化形成离子型化合物，从而回到水相流动相中, 因此酸性溶质始终被限制在保留酸界面，形成溶质的高浓度洗脱特征。
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图 1 pH区带精制逆流色谱分离机制 Figure 1 The separation mechanism of pH-zone-refining countercurrent chromatography |
根据目标物质的pKa和疏水性，杂质通常被浓缩在相邻2个目标物质的外部边缘，目标物质以高度集中的矩形峰形式随洗脱剂依次流出，这一洗脱特征非常类似于传统置换色谱法(Displacement chromatography)，但这2种方法之间有着明显的差异[4]。置换色谱主要采用置换剂将样品置换出来，置换剂与固定相之间的作用能力大于样品与固定相之间的作用能力，各组分根据其与固定相的吸附强弱依次被洗脱出来，分别形成一系列连续的高浓度纯物质矩形区。因此2种方法有以下几点区别：首先，置换色谱原理是根据固定相对样品与置换剂的吸附力差异来实现分离的，而pH区带逆流色谱是根据被分析物酸碱性强弱以及溶质在固定相与流动相中分配差异来实现分离；其次，决定分析物浓度的因素不同，置换色谱是由置换剂的浓度来决定流出液的浓度，而pH区带精制逆流色谱是由流动相对各分析物的溶解度大小来决定的；另外，pH区带精制逆流色谱的固定相为溶剂，避免了不可逆吸附，具有制备量大且连续化优势；最后，pH区带精制逆流色谱具有2种操作模式，反向置换模式与正向置换模式。
关于pH区带精制逆流色谱研究进展的综述报道较多[4-5, 10-12]，但几乎所有的综述文献都是根据其分离对象来进行分类总结的，缺乏对相关理论与洗脱过程问题的必要探讨，对该技术在手性分离领域的研究也未有相关综述，特别是其核心问题溶剂体系筛选以及出峰顺序、峰重叠等研究缺乏必要的文献综述与报道。本文主要根据pH区带精制逆流色谱中两相溶剂体系组成的发展过程，以及在天然产物、合成产物以及手性分离领域中的应用，对分离中出现的出峰顺序、峰重叠等技术关键问题进行相关的综述。
1 两相溶剂体系及保留酸(碱)/洗脱碱(酸)的研究进展普通逆流色谱分离过程中最为关键的是寻找合适的两相溶剂体系，而采用pH区带逆流色谱分离目标化合物除了两相溶剂体系的选择外，合适的保留酸(碱)与洗脱碱(酸)同样非常重要。该方法主要是依据分离物质的解离常数(pKa)和疏水性的差异而实现目标成分的分离，溶质的疏水性差异主要通过调节两相溶剂体系的组成、比例而实现。众所周知，分离物质的解离常数(pKa)在一定条件下为常数，而相应物质的解离状态或程度主要由保留酸(碱)/洗脱碱(酸)决定。因此，对于pH区带逆流色谱来说，两方面的影响都非常大，导致矩形峰宽度、保留时间出现相应变化，甚至引起出峰顺序的改变。
该技术常用的两相溶剂体系主要由乙醚-水、叔丁基甲醚-水等溶剂体系组成，或在上述溶剂体系中加入乙腈、四氢呋喃、正丁醇等溶剂进行调节以改变样品的溶解度或分配性质。逆流色谱发明人Y. Ito在其系统的综述中就引用乙醚-水体系介绍了这项技术的使用操作过程[4]，由于乙醚易挥发、安全隐患大等缺陷，往往采用叔丁基甲醚进行代替。因此，在上世纪90年代该项技术首次报道后的近20年里，在筛选pH区带逆流色谱的体系时，大多数研究者都会从叔丁基甲醚-水(1：1，v/v)体系开始选择适合的溶剂体系[13-16]。叔丁基甲醚-水(1：1，v/v)体系适用范围很广，可应用于生物碱、有机酸等化合物成分分离。如Vieira等[17]运用该体系从夹竹桃科树皮中分离出3种生物碱，其中3-阿锐素和异利血平灵为首次从该药材中被分离纯化的单体。如果叔丁基甲醚-水体系不能达到理想的分离效果，则也可在该体系中加入一些中等极性的溶剂以降低有机相的疏水性[18-22]，同时还增加了样品的溶解性。因此在该体系中增加一些有机溶剂来调节系统的分离效果和增加样品进样量是十分常见的。
叔丁基甲醚-水体系主要缺陷为叔丁基甲醚刺激性大，近年来很多学者逐渐研究采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-正丁醇-水体系[20, 23-25]，在合适的组成以及配比情况下，同样取得了良好的分离效果。在分离极性较大的生物碱时也可以直接采用强极性的溶剂，如Cruz等[25]运用该色谱法采用乙酸乙酯-水体系分离纯化得到3种莨菪烷类生物碱。Weisz等[26]在开发颜料添加剂D & C绿色No. 8 (G8)时，采用两相溶剂系统为正丁醇-水(1：1，v/v)，20%十二胺作疏水性离子，使磺化组分进入有机相中作为保留酸，在水相中添加0.1 mmol·L-1氢氧化钠作为洗脱剂，结果从20.3 g G8中分离得到0.58 g芘三磺酸钠，纯度大于99%。虽然该体系的分离效果很好，但是在多次实验研究中发现这种体系对样品的溶解性较低，制备量不能实现最大化。因此，pH区带逆流色谱溶剂体系筛选过程中，既要满足上述分配系数的要求，也希望该体系对样品的溶解度足够大。若两方面不能同时满足条件，则进行折中考虑。相比较而言，氯仿体系对样品具有非常好的溶解能力，尤其是生物碱样品, 不仅对样品的溶解度高，而且分离效果良好，因此该体系得到了广泛的应用[27-30]，但是氯仿具有一定的毒性。近年来，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-正丁醇-水体系在分离有机酸类成分[31-35]和异喹啉类生物碱[36-38]时最为常用。表 1总结了近年来pH区带精制逆流色谱所报道的几类主要的溶剂体系以及被分离对象。
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表 1 pH区带精制逆流色谱常用溶剂体系 Table 1 Biphasic solvent systems used in pH-zone-refining countercurrent chromatography |
影响pH区带逆流色谱分离的另一个因素是保留酸(碱)和洗脱碱(酸)的选择。常用的有机保留碱为三乙胺，无机保留碱为氨水，有机洗脱酸为三氟乙酸，无机洗脱酸为盐酸，一般的浓度范围为5~20 mmol·L-1。若被分离物质的酸(碱)性较小，可采用酸碱性更强的保留酸(碱)或洗脱碱(酸)，或适当提高其浓度，用于改善分离效果或缩短分离时间。李怀志等[34]采用乙酸乙酯-水体系，在上相中加10 mmol·L-1三氟乙酸，下相中加10 mmol·L-1氨水, 实现了丹酚酸B和迷迭香酸的分离，但是所需要的洗脱时间太长，当洗脱碱氨水浓度增加为20 mmol·L-1时，分离时间被大幅度缩短，并且不影响分离组分的纯度。通过增加流动相洗脱碱的浓度来加快洗脱速度，实现了对丹酚酸B和迷迭香酸的快速分离。但是，保留酸(碱)或洗脱碱(酸)的浓度并非越大越好，Dong等[22]从燕麦中分离有机酚酸类成分时，对比了3种不同浓度的保留酸和洗脱碱，浓度比分别为10：10、6：6和3：3。但是前两者都不能达到良好的分离效果，最后1种浓度比却能很好地分离7种成分。在分离弱酸性化合物时，除了增加洗脱碱的浓度外，还可以将洗脱剂换成强碱。笔者所在课题组[42]在进行大黄蒽醌类成分的分离过程中，由于大黄酚酸性太弱，无机洗脱碱氨水无法使其离子化，进而不能形成有效的分配系数，因此采用碱性更强的氢氧化钠代替氨水，取得了良好的分离效果。在分离长松萝中的有机酸时[35]，研究者在流动相中加入10 mmol·L-1氨水时无法实现粗样品中6种成分的分离，之后将洗脱碱换为10 mmol·L-1氢氧化钠时，成功地将6种化合物分离开来，之后为了缩短分离时间，增加洗脱碱氢氧化钠的浓度为20 mmol·L-1，使得分离时间缩短了4 h。因此选择合适的保留酸(碱)或洗脱碱(酸)的浓度对分离效果有着十分显著的影响。
大多数文献表明流动相中洗脱酸(碱)的浓度一般约等于保留碱(酸)浓度，洗脱酸(碱)浓度决定了每一个洗脱组分的浓度，增加洗脱酸(碱)浓度可使被分离组分的浓度增加、保留时间缩短[4, 23-24, 37, 43]。相反，固定相中保留碱(酸)的浓度决定了分离柱内固定相中被分离组分的浓度，增加固定相中保留碱(酸)的浓度可以增加固定相中分离组分的浓度、延长保留时间、提高被分离组分的K值[27, 30]。一般来说，制备量大时可以采用高浓度的保留剂和洗脱剂，如40 mmol·L-1，但是使用这种高浓度会导致固定相从色谱柱中被携带出来。这可能是由于固定相中保留碱(酸)的浓度过高导致两相乳化或者固定相对样品的溶解度有限使目标成分析出而引起的[41, 43]。
在分离一些处于pH区不稳定的化合物时，还可以加入一种配基，如二-(2-乙基己基)磷酸(DEHPA)，利用配基与样品中一些较为复杂的组分形成配位，从而使各组分之间的分配系数差异变大[4-5, 44]。秦秋香等[45]在上相中加入20 mmol·L-1三乙胺和20%磷酸二-(2-乙基己基)酯(DEHPA)作为固定相，下相中加盐酸作流动相，成功地对酶解液中的混合组分进行了分离，得到了5个高F值(F＞20)的分离组分。
2 pH区带逆流色谱在手性分离中的应用pH区带逆流色谱分离手性化合物的研究机理与非手性分离过程类似，但是该技术分离手性化合物时最为关键的是手性试剂对外消旋体化合物的手性识别能力不能被破坏。因此溶剂体系中的保留酸(碱)或洗脱碱(酸)需加入一种手性试剂，这是能否采用pH区带精制逆流色谱分离手性化合物的关键点。由于手性试剂的选择困难以及多种影响因素的限制，所以该项技术在手性分离中的研究报道目前还非常少。在pH区带精制逆流色谱手性分离中，基于2个手性对映体之间存在同一个pKa，那么对映体之间的出峰顺序主要取决于其疏水性强弱，而疏水性强弱的差异则通过溶剂体系中手性试剂与对映体之间结合力的差异体现出来。若2个对映体之间产生pH区带重叠，即没有完全分离，主要原因在于手性试剂与对映体之间的作用力差异不够大[46]。
对于手性化合物拆分来讲，被分离溶质的2种对映体成分其酸碱性应该一致，即pKa相同，因此，对映体与手性试剂形成的配合物之间疏水性大小的差异决定了是否能形成pH区带且将对映体拆分开来。没有手性试剂存在的情况下，对映体之间的疏水性大小完全一样。在手性pH区带分离中，疏水性大小的差异来源于手性试剂与对映体之间结合力的不同。因此，对于pH区带的手性拆分而言，pH之间的差异值可以表示为：
| $ \begin{align} & \rm{ }\!\!\Delta\!\!\rm{ pH=p}{{\rm{H}}_{\rm{+}}}\rm{-p}{{\rm{H}}_{\rm{-}}}\rm{ }\!\!~\!\!\rm{ } \\ & \ \ \ \ \ \ \ \ \ \rm{=(p}{{\rm{H}}_{\mathit{a}\rm{+}}}\rm{-p}{{\rm{H}}_{\mathit{a}\rm{-}}}\rm{)+log}\frac{{{\mathit{D}}_{\rm{o}}}\left( \rm{1+}{{\mathit{k}}_{\rm{f+}}}{{\left[ \mathit{CS} \right]}_{\rm{org}}} \right)\rm{-}{{\mathit{K}}_{\rm{R,app}}}}{{{\mathit{D}}_{\rm{o}}}\left( \rm{1+}{{\mathit{k}}_{\rm{f-}}}{{\left[ \mathit{CS} \right]}_{\rm{org}}} \right)\rm{-}{{\mathit{K}}_{\rm{R,app}}}} \\ \end{align} $ | (1) |
由公式(1)知，对于pH区带手性分离来讲，其pH区带的“选择性”，即pH区带之间的差异值主要与手性试剂与对映体之间结合常数kf之间的差异、手性试剂浓度的大小以及保留酸(碱)的浓度有关。其对映体之间的出峰顺序与普通高速逆流色谱的出峰顺序相同，分离度的影响因素也基本一致，只是在pH区带精制逆流色谱中还受到保留酸(碱)与洗脱碱(酸)浓度的影响。
本课题组[47]采用pH区带逆流色谱技术分离β-受体阻滞剂类药物普萘洛尔，由于普萘洛尔对映体属于有机碱类手性药物，选用溶剂体系为氯仿：水相(1：1)，有机相氯仿中含0.1 mol·L-1手性试剂L-酒石酸正己酯，添加20 mmol·L-1三乙胺作为保留碱，水相为0.1 mol·L-1硼酸，添加5 mmol·L-1盐酸作为洗脱酸，可一次性拆分356 mg普萘洛尔对映体。Ito等[4]在分离手性化合物二硝基苯亮氨酸和二硝基苯缬氨酸时，选用联吡啶酰胺(DPA)作为配体，溶剂体系为甲基叔丁基醚-水，在有机固定相中加40 mmol·L-1三氟乙酸和40 mmol·L-1 DPA配体，水相中加20 mmol·L-1氨水，成功实现2种外消旋体手性化合物的分离。Pérez等[48]也应用该技术分离吲哚洛尔和华法林，实现了良好的对映体拆分。
3 pH区带逆流色谱出峰顺序与峰重叠问题在pH区带精制逆流色谱分离中，pH区带的重叠不仅受到被分离溶质疏水性强弱的影响，同时也受到pKa值大小的影响。pH区带之间的区带“选择性”可以定义为2个连续区带之间的pH差异：
| $ \begin{align} &\text{ }\!\!\Delta\!\!\text{ pH=p}{{\text{H}}_{\text{i+1}}}\text{-p}{{\text{H}}_{\text{zi}}} \\ &\ \ \ \ \ \ \ \ \text{=}\left( \mathit{p}{{\mathit{K}}_{\text{ai+1}}}\text{-}\mathit{p}{{\mathit{K}}_{\text{ai}}} \right)\text{+log}\left\{ \left( {{\mathit{K}}_{\text{i+1}}}\text{-}{{\mathit{K}}_{\text{R, app}}} \right)\text{/}\left( {{\mathit{K}}_{\text{i}}}\text{-}{{\mathit{K}}_{\text{R, app}}} \right) \right\} \\ \end{align} $ | (2) |
公式(2)表示区带的pH与被分离溶质的解离常数有直接关联，同时只有当被分离溶质之间的疏水性或亲水性程度相差不大时，pH区带的形成才取决于溶质的解离常数，换而言之，如果溶质之间的疏水性程度相差很大，以至于这种影响程度超出了解离常数的影响，那么溶质的pH区带完全有可能发生前后更换顺序或是重叠的现象。Billardello等[49]以邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸和对羟基苯甲酸3个化合物为研究对象，最早开始研究探讨这个问题。分为4种不同的情况来讨论：以分离酸性溶质为例，(1)酸性溶质具有较强的酸性以及较小的疏水性。这种情况下的酸性溶质总是被首先洗脱出来。这种情况就是pKa1＜pKa2，并且分配系数K1＜K2；(2)酸性溶质具有较强的酸性同时也具有较大的疏水性，但是依然被首先洗脱出来。这种情况就是属于pKa1＜pKa2，但分配系数K1＞K2；(3)酸性溶质具有较强的酸性同时也具有较大的疏水性，但是它在后面才被洗脱出来，这种情况是属于pKa1＞pKa2，但分配系数K1＜K2；(4)当酸性溶质的酸性pKa与疏水性强弱2种效应差不多时，有可能造成2个溶质以混合物的形式被洗脱出来，这种情况可以是pKa1＜pKa2，但分配系数K1＞K2，也可以是pKa1＞pKa2，但分配系数K1＜K2。通过相关实验与数据模拟，得出相关结论：在合适的pH区带逆流色谱分离条件下，为最大限度抑制峰重叠，应尽可能选用较高的保留酸(碱)和洗脱碱(酸)的浓度。Weisz等[50]在分离各种酸性溶质异构体时，观察到峰重叠现象，对被分离酸性溶质的二聚体等进行相关分析，通过提高保留酸浓度，也取得了避免峰重叠的现象。Ito[43, 51]也提出：所有形成的区带浓度都与置换剂的浓度相等，这个理论对于降低或抑制峰重叠的方法是将洗脱剂和保留剂的浓度提高。
随后，有其他文献对出峰顺序与峰重叠问题也作了相关研究报道[35, 43, 50, 52]。本课题组[52]采用pH区带逆流色谱分离金银花中3种同分异构体咖啡奎宁酸时，发现这3种成分的洗脱顺序与高效液相的出峰顺序不一致，于是对这3种成分的洗脱顺序进行了探讨。Sun等[35]以长松萝中的苔色酸、4-氧-甲基苔色酸、地钱酸、须松萝酸、地弗地衣酸和松萝酸6种成分为研究对象，进行了出峰顺序方面的实验与理论探讨。
4 结论pH区带精制逆流色谱技术已经广泛应用于离子型化合物的分离制备中，其两相溶剂体系的组成与应用近年来出现了一些相应的变化，尤其是低毒、环保溶剂体系的应用研究是今后的发展趋势。应用pH区带逆流色谱技术的关键步骤是两相溶剂体系和保留酸(碱)/洗脱碱(酸)的筛选，根据常用的两相溶剂体系及保留酸(碱)/洗脱碱(酸)，按照不同的体积比逐一筛选，然后再适当的调整体系中的疏水性和酸碱度以达到理想的分离效果。在合适的条件下，pH区带逆流色谱可用于制备性分离手性化合物。关键是寻找合适的手性试剂，溶剂体系中的保留酸(碱)或洗脱碱(酸)对手性识别过程不能造成严重影响以及两相溶剂体系的筛选，这成为能否采用pH区带精制逆流色谱分离手性化合物的关键。pH区带精制逆流色谱中基于被分离溶质受到pKa与疏水性强弱两方面的影响。主要有3种原因引起pH区带逆精制流色谱中2个溶质的分离区带重叠：第1种是进样量的增加引起色谱柱的过载，第2种是被分离的溶质在疏水性大小与酸碱性pKa相差不大，第3种情况是疏水性大小与酸碱性相差都比较大，但是这2种作用互相抵消。
pH区带精制逆流色谱技术由于其分离制备量大，效率高，纯度高等优点，现已广泛应用于很多天然产物制备性分离、粗提物中杂质的去除、目标化合物的精制和合成混合物的拆分，能对具有酸碱性的化合物进行分离纯化，解决了很多普通分离技术不能解决的问题，并且其两相溶剂系统的筛选已有一套相对成熟的规则，比较容易找到适合的溶剂体系，操作也很简单，可以用于大规模制备型分离目标化合物，为离子型天然产物和合成产物的分离提纯工作带来了极大地帮助，在未来产业化生产中具有较大的潜力，应用前景广阔。
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