2018, Vol. 38 
2. 黑龙江省食品药品检验所, 哈尔滨 150088;
3. 浙江省食品药品检验研究院, 杭州 310004;
4. 四川省食品药品检验所, 成都 610061;
5. 广东省药品检验所, 广州 510180
2. Heilongjiang Institute for Food and Drug Control, Harbin 150088, China;
3. Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310004, China;
4. Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610061, China;
5. Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China
方法验证是所有分析测量科学的基础，采用经过验证的实验方法是获得可靠检验结果的基本保证[1]。我国药品微生物检验标准化研究一直较为落后[2-3]，中国药典2005年版开始引入微生物检验方法验证试验要求[4]，中国药典2010年版的微生物检验方法验证沿用了中国药典2005年版的规定[5]，中国药典2015年版微生物限度检查法基本与USP等国际(ICH)方案接轨[6-8]，并将方法验证实验调整为方法适用性试验。中国药典2015年版微生物限度检查微生物计数法(通则1105)方法适用性实验中规定，应首先在供试液环节加入验证菌株进行回收率测定[9]，如果样品的抑菌作用无法避免，供试液经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入菌悬液进一步试验[10]。这一规定与中国药典2010年版存在很大的不同，主要是进一步考虑了污染微生物在供试液环节所受影响的验证需求。为全面考察不同加菌方式在实际方法验证中的通过情况，本文选择有代表性的95种样品，对不同加菌环节进行实验研究，通过对2900多组实验数据的综合分析，表明中国药典2015年版(通则1105)规定在供试液环节加入验证菌株较为合理。
1 实验条件与材料 1.1 仪器设备与器材(中检院)EQUINOX薄膜过滤仪(Millpore)；NS01-75D薄膜过滤器(批号：20111223，北京牛牛基因技术有限公司)；培养箱(Binder)，其他实验单位采用类似设备与器材。
1.2 实验用菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]均由中国食品药品检定研究院提供。
1.3 实验样品共95种样品，可分为中成药44种、化学药品41种；也可分为无抑菌活性(指可按1：10供试液1 mL·皿-1的平皿法进行计数测定)品种40种、弱抑菌活性(指需要采用1：10供试液小于1 mL·皿-1的培养基稀释法进行计数)品种25种、有抑菌活性(指需要采用薄膜过滤法进行计数测定)品种30种，基本涵盖了非无菌制剂的各种情况，具有广泛的代表性。
2 实验方法按微生物限度检查方法验证试验，分别在样品环节、供试液制备环节和最后环节(倾注平皿环节、或薄膜过滤法的最后一次冲洗液中)加入验证菌株，进行回收率测定。设定为A、B、C 3组，分别以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉测定各样品A、B、C 3组的回收率，以中国药典2010年版规定的70%的回收率为标准统计每一品种通过验证的加菌环节，以比较分析各种加菌方式在不同样品中存在的差异。
3 实验结果95种样品不同加菌环节的方法验证回收实验通过情况见表 1。表 1加菌方式栏中A代表在样品阶段加菌即可满足全部5株菌回收率大于70%的品种；B代表在供试品溶液中加菌可满足全部5株菌回收率大于70%的品种；C代表只有在最后阶段加菌才可以满足全部5株菌回收率大于70%的品种。能在A阶段加菌通过验证的品种即能在B、C阶段加菌通过验证实验；能在B阶段加菌通过验证的品种即能在C阶段加菌通过验证试验。
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表 1 95个样品微生物限度检查方法验证实验供试液加入方式及验证菌株加入方式 Table 1 Methods of sample solution addition and methods of validation strain addition for the microbial limittest validation on 95 samples |
从表 1数据分析可以看出，以中国药典2010年版70%回收率为标准，验证试验可以在样品阶段加菌的占38%；需要在最后阶段加菌才能满足验证试验要求的品种数比例在45%；而在供试液制备好后将菌液加入其中再进行后续实验可以满足验证试验要求的占到55%，如果以中国药典2015年版50%回收率为标准，这一比例可以提高到80%。
即使一般认为没有抑菌活性的品种，从本次研究涉及到的40个品种来看，仍有15%的品种不能在最后阶段之前进行加菌回收试验；对于有弱抑菌活性的品种，有12%的品种可以直接在样品环节进行加菌回收试验；对于有较强抑菌活性的品种，也有近17%的品种可以在样品阶段即加入对照菌株，其验证试验的回收率仍然满足要求。从整体上看，不管有无抑菌活性，中成药品种在验证试验中提前加入对照菌的回收试验情况好于化学药品种。
通过实验研究表明，综合考虑实验方案的可行性、样品和操作过程的影响因素，在供试液阶段加入验证菌株是最合理的选择。
5 讨论 5.1 方法验证试验的本质通过本文研究可以看出，影响微生物限度检查方法验证加菌回收率试验结果的因素包括两方面：
一是样品因素。样品的抑菌活性和理化特性可能抑制或破坏微生物生长，综合表现为抑菌能力。在检验过程中随着样品的处理、供试液制备、稀释、注皿或薄膜过滤及冲洗等，样品的抑菌能力在不断变化，总体上对微生物的生长抑制作用逐渐弱化，最终是有利于微生物良好生长[11]。目前有无抑菌活性的判断是根据中国药典现有验证方法在完成前处理或稀释后的最后阶段加菌的生长情况做出的，但认为无抑菌活性的样品完全可能在样品阶段或供试液阶段，由于较高的样品浓度、较高的渗透压、较强的离子强度、不适宜的pH等对微生物生长具有抑制能力或不利于微生物的存活[12]。这样可以部分解释本研究中一些没有抑菌活性的样品在样品阶段(A)或供试液阶段(B)加菌回收试验失败。
二是操作因素。对加菌样品进行分散、稀释、转移等操作过程，由于微生物分布不均一、沉降、吸附、机械损伤、热损伤等，造成微生物损失，影响回收得率[13]。
样品因素主要体现生物活性和化学影响，操作过程更多体现物理影响。对于一个试验过程，两者是紧密结合不可分割的，还有一些因素贯穿两者之中，比如说时间因素。抑菌能力的具体体现与微生物接触样品的时间相关，某些操作过程的时间长短直接影响得率，所以本研究中会出现明明有抑菌活性的品种，但在样品阶段(A)、供试液阶段(B)和最后阶段(C)加菌回收都能满足要求。可能对于这些品种，操作过程的时间与最后培养阶段对微生物生长发挥作用的时间相比是可以忽略的。
基于上述分析可以看出，方法验证试验的本质就是建立样品影响更小、操作得率更高的实验方法，加菌回收试验设计应该尽量满足这一需求。
5.2 方法验证试验加菌环节的确定理论上微生物限度检查方法验证试验中的加菌回收试验尽早加入对照菌株更符合回收试验的一般要求，即最好在样品环节加菌，因为这样可以更为贴近样品中污染微生物从供试液制备、前处理到检出的全过程，不仅反映了检验过程中样品因素对检出对象的影响，也考虑到了检验过程尤其是供试液制备过程的影响。
从这一意义看，中国药典2010年版规定在培养基环节加菌不及中国药典2015年版规定科学。验证试验中提早加菌回收这一理想状态在现实中很难实现，根本问题在于样品中污染微生物与参与回收试验的标准菌株不一致，即污染微生物可能由于对样品的耐受可以经受从供试液制备、前处理的全过程而得以检出，而添加的标准对照菌株由于其敏感性却可能无法耐受这一过程，从而造成验证试验失败，但是这种失败并不一定说明该检验方法不可行；对于标准菌株耐受的样品可以提倡提前加菌，不同样品会有很大的不同。
5.3 方法验证试验加菌环节的实际应用本文的研究结果显示，中国药典2015年版微生物限度检查方法适用性试验实施应注意以下几点：加菌前移至供试液环节；如果从供试液低稀释级入手回收达不到要求，可以逐步到更高稀释级；如果样品的抑菌作用仍然无法避免，样品经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入菌悬液进一步试验；由于方法验证的复杂性，抑菌活性难以消除，无限制的稀释或处理已经对标准判断或检验操作没有意义，可以结合风险评估采用最接近的检验方法。
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