2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
2. 甘肃省药品检验研究院, 兰州 730070;
3. 松原市食品药品检验所, 松原 138000
2. Gansu Institute for Drug Control, Lanzhou 730070, China;
3. Songyuan Institute for Food and Drug Control, Songyuan 138000, China
重楼具有抗肿瘤，镇静镇痛，止咳平喘，免疫调节，止血等作用[1-2]，是云南白药、季德胜蛇药的主要原料，需求量很大[3]。《中华人民共和国药典》(以下简称中国药典)2015年版收载的重楼药材的正品来源为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎[4]。重楼药用价值高，用量大，但生长周期长，自然繁殖率低，且重楼对生长环境要求比较苛刻，人工种植发展缓慢[5]。重楼在栽培品过程中，缺乏对物种的鉴定，常出现一片大田中多种重楼混种的现象，采收后均作为重楼药材流入市场。由于重楼属不同种植物的根茎形态、组织结构极近似，且化学成分的研究也不够深入等问题，仅以性状、显微鉴定等传统鉴定方法和中国药典理化方法来鉴定重楼正伪品难度较大。因此，对药用重楼栽培品建立快速、有效的鉴定方法十分必要。
DNA条形码(DNA barcoding)是选用标准短的DNA片段对物种进行快速、准确的自动化鉴定和识别[6]，由Paul Hebert首先提出将条形码技术引进生物的鉴定中[7]。中药鉴定是研究中药品种、质量，制定中药标准，寻找和扩大药源的前提和基础，DNA分子标记可以弥补和克服传统鉴定方法的一些缺陷和难题[8]。DNA条形码技术是近年来生物分类和鉴定的研究热点，在物种鉴定方面显示了广阔的应用前景[8-11]。
本试验收集多产地的重楼药材栽培品，并收集6批野生重楼样品，采用DNA条形码技术，选取ITS和ITS2 2对引物进行鉴别，希望从分子生物学水平确定目前栽培重楼的主要物种，为栽培重楼的正本清源提供依据，并比较相同物种中野生品与栽培品的碱基差异。
1 材料和方法 1.1 材料AB135-S分析天平(Mettler公司)，Milli-Q Biocel纯水仪(Millipore公司)，MM400球磨仪(Retsch公司)，HH-4数显恒温水浴锅(友联仪器公司)，ABI Veriti PCR仪(ThernoFisher公司)，EPS-301电泳仪(Amersham公司)，GelDoc XR+全自动凝胶成像系统(BIORAD公司)。
植物基因组DNA提取试剂盒(DP305，天根生化科技有限公司)；2×Taq Master Mix缓冲液(GK8006，GENEray)；GelRed(41003，Biotium)；琼脂糖(BIOWEST)；Tris-base(Sigma)；冰醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；EDTANa2·2H2O(国药集团化学试剂有限公司)。引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′(ITS)；引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′(ITS2)(上海捷瑞生物工程有限公司)。
实验共收集重楼样品60批，其中CL-15、CL-23、CL-25、CL-26、CL-27、CL-28为6批野生重楼样品，另外54批均为栽培重楼样品。样品信息见表 1。
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表 1 样品信息表 Table 1 Samples information |
取样品根或叶20~30 mg，用球磨仪粉碎，利用植物基因组提取试剂盒进行DNA提取。
1.3 聚合酶链式反应及测序PCR反应体系20 μL：2×Taq Master Mix缓冲液10 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，灭菌的双蒸水8.2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸7 min。
1.4 扩增产物测序将电泳结果显示为单一明亮条带的扩增产物送英潍捷基进行测序。
1.5 数据处理测序峰图使用CodonCode Aligner3.7.1软件(CodonCode Co.，USA)校对拼接，去除引物区段。将所有序列利用MEGA 6.0软件分析比对。基于K2P模型进行遗传距离分析，用NJ法(Neighbor-Joining Tree)建立聚类树，通过bootstrap(1 000次重复)对各分支进行支持率检验。
2 结果 2.1 Genbank比对将CodenCode Aligner处理后的数据在NCBI的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站上进行比对，综合ITS和ITS2 2种序列的比对结果，最终确定60批样品共涉及10个种，分别为宽瓣重楼、毛重楼、七叶一枝花、花叶重楼、独龙重楼、五指莲重楼、西藏延龄草、平伐重楼、华重楼、南重楼，其中宽瓣重楼、华重楼与中国药典收载品的拉丁名一致。中文名与拉丁名对照表见表 2。
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表 2 样品中文名与拉丁名对照表 Table 2 The corresponding table for samples' Chinese names and Latin names |
分别基于ITS和ITS2序列建立重楼样品的NJ树图(图 1、2)，结果表明各个种的ITS序列都能分别聚到1支，且支持率达到50%以上。ITS2序列除宽瓣重楼外，各个种样品分别聚到1支，且支持率达到50%以上。
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Bootstap 1 000次重复，支上数值仅显示自展支持率≥50%[Bootstrap scores(1 000 replicates)are shown(≥50%)for each branch] 图 1 基于ITS序列建立的NJ树 Figure 1 Phylogenetic tree of the ITS sequences by NJ method |
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Bootstap 1 000次重复，支上数值仅显示自展支持率≥50%[Bootstrap scores(1 000 replicates)are shown(≥50%)for each branch] 图 2 基于ITS2序列建立的NJ树 Figure 2 Phylogenetic tree of the ITS2 sequences by NJ method |
在本实验60批样品的ITS序列中，西藏延龄草和花叶重楼均只有1批样品，平伐重楼2个样品为同一单倍型，不存在种内变异，其他样品的种内变异分析见表 3。在本实验60批样品的ITS2序列中，花叶重楼只有1批样品，西藏延龄草的2批样品、平伐重楼的3批样品、七叶一枝花的4批样品、五指莲重楼的10批样品均分别为同一单倍型，不存在种内变异，其他样品的种内变异分析见表 4。
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表 3 ITS序列的单倍型及种内遗传距离 Table 3 Intra-specific genetic distance and haplotype analysis of ITS sequences |
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表 4 ITS2序列的单倍型及种内遗传距离 Table 4 Intra-specific genetic distance and haplotype analysis of ITS2 sequences |
从表 5和表 6可以看出：南重楼的ITS序列与毛重楼的平均种间遗传距离最小，为0.060；ITS2序列与花叶重楼的平均种间遗传距离最小，为0.102。华重楼的ITS序列与平伐重楼的平均种间遗传距离最小，为0.028；ITS2序列与平伐重楼的平均种间遗传距离最小，为0.033。独龙重楼ITS序列与五指莲重楼的平均种间遗传距离最小，为0.025；ITS2序列与宽瓣重楼的平均种间遗传距离最小，为0.036。毛重楼ITS序列与宽瓣重楼的平均种间遗传距离最小，为0.013；ITS2序列与宽瓣重楼的平均种间遗传距离最小，为0.012。宽瓣重楼ITS序列与毛重楼的种间遗传距离最小，为0.013；ITS2序列与花叶重楼的平均种间遗传距离最小，为0.102。西藏延龄草ITS序列与五指莲重楼的平均种间遗传距离最小，为0.072；ITS2序列与平伐重楼的平均种间遗传距离最小，为0.078。七叶一枝花ITS序列与毛重楼和宽瓣重楼的平均种间遗传距离最小，为0.028；ITS2序列与宽瓣重楼的平均种间遗传距离最小，为0.029。平伐重楼ITS序列与华重楼的平均种间遗传距离最小，为0.028；ITS2序列与华重楼的平均种间遗传距离最小，为0.029。花叶重楼ITS序列与毛重楼和宽瓣重楼的平均种间遗传距离最小，为0.028；ITS2序列与宽瓣重楼的平均种间遗传距离最小，为0.019。五指莲重楼ITS序列与独龙重楼的平均种间遗传距离最小，为0.025；ITS2序列与独龙重楼的平均种间遗传距离最小，为0.043。
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表 5 ITS序列的平均种间遗传距离 Table 5 The average inter-specific genetic distance of ITS sequences |
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表 6 ITS2序列的平均种间遗传距离 Table 6 The average inter-specific genetic distanceof ITS2 sequences |
除南重楼的ITS序列与毛重楼、花叶重楼的平均种间遗传距离小于南重楼的最大种内遗传距离外，各个种的ITS和ITS2序列的最大种内遗传距离均小于其最小种间平均遗传距离，说明ITS和ITS2序列相结合，可以有效区分栽培重楼样品的各个种。
2.5 扩增效率及测序成功率ITS和ITS2的扩增效率均为100%，测序成功率分别为75%和100%。其中ITS2全部测序成功，而ITS有15个样品未测序成功，分别为CL-3、CL-6、CL-23、CL-24、CL-25、CL-27、CL-30、CL-33、CL-34、CL-35、CL-36、CL-39、CL-40、CL-53、CL-54。
2.6 野生品与栽培品的变异位点比较分析60批重楼样品中共有野生品6批，分别为毛重楼CL-15、西藏延龄草CL-23、独龙重楼CL-25、五指莲重楼CL-26和CL-28、宽瓣重楼CL-27，其中CL-23、CL-25、CL-27的ITS序列测序失败，不能对其野生品与栽培品的碱基差异进行比较；西藏延龄草和五指莲重楼所有样品的ITS2序列均分别一致，因此野生品CL-23、CL-26、CL-28与相应栽培品的碱基比较未进行列示，所有野生品与栽培品的ITS和ITS2序列的碱基[腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)]比较情况如表 7~11所示，野生品与栽培品的碱基差异很小，甚至完全一致。
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表 7 毛重楼野生品与栽培品ITS序列碱基差异的比较 Table 7 Base differences in ITS sequences betweencultivated and wild Paris mairei |
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表 8 五指莲重楼野生品与栽培品ITS序列的碱基差异的比较 Table 8 Base differences in ITS sequences between cultivated and wild Paris axialis |
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表 9 毛重楼野生品与栽培品ITS2序列的碱基差异的比较 Table 9 Base differences in ITS2 sequences between cultivated and wild Paris mairei |
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表 10 独龙重楼野生品与栽培品ITS2序列的碱基差异的比较 Table 10 Base differences in ITS2 sequences between cultivated and wild Paris dulongensis |
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表 11 宽瓣重楼野生品与栽培品ITS2序列的碱基差异比较 Table 11 Base differences in ITS2 sequences between cultivated and wild Paris polyphylla var.Yunnanensis |
本研究选用ITS和ITS2 2对引物，对所收集的60批重楼样品进行DNA条形码研究，其中ITS和ITS2序列的扩增效率均为100%，测序成功率分别为75%和100%。虽然ITS2的测序成功率为100%，但是ITS2用于分析和比对的序列长度很短，只有200+bp，种间变异小，对于比较相近的种，仅凭ITS2序列很难有效区分；ITS序列的测序成功低于ITS2，仅为75%，但是ITS序列长度大概为600+bp，可以有效区分不同重楼品种。因此，采用ITS和ITS2 2个序列相结合的方法，通过与NCBI上已有序列进行比对，有效地将60批重楼样品鉴别到种。
从ITS和ITS2的比对结果可知，本研究所收集的60批重楼样品中共涉及10个种，分别为宽瓣重楼、毛重楼、七叶一枝花、花叶重楼、独龙重楼、五指莲重楼、西藏延龄草、平伐重楼、华重楼、南重楼，其中宽瓣重楼、华重楼与中国药典收载品云南重楼、七叶一枝花的拉丁名一致。其他8个物种的重楼虽然不在中国药典的收载范围内，却也被大量种植，最终流入市场，导致市场上重楼药材的混乱现状。由于重楼药材的药用部位为根，仅通过性状很难鉴别中国药典收载品与混伪品，这也是市场上混伪品横行的原因。
从碱基比较结果上看，野生重楼样品与栽培重楼样品的碱基差异很小，甚至完全一致。进一步证明，重楼栽培样品的混乱现状并不是由于人工驯化导致其同基原样品性状表现多元化，而是由于栽培之初未对品种进行有效鉴别造成的。大多数栽培者不具备鉴别重楼物种的能力，是导致重楼栽培现象混乱的重要原因，且重楼栽培过程中也存在将野生品直接移栽到大田的现象，甚至会出现同一大田中栽培多个重楼物种的现象，其栽培现状非常混乱。
对重楼DNA条形码的研究已有报道，姜黎等[12]对4条不同的单序列片段matK、trnL-trnF、rpoC1、ITS及其两序列组合片段和三序列组合片段，在重楼正品与其常见近缘种的鉴别方面进行了研究，其结论为：ITS序列作为DNA条形码候选序列，能够鉴定重楼与其常见近缘种及饮片，同时推荐ITS+trnL-trnF组合序列作为其补充序列。朱英杰等[13]从psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK、ITS2中，筛选出扩增效率和测序成功率均为100%的ITS2序列，能够准确鉴定重楼属药用植物，对重楼属29个种67份样品的鉴定成功率为100%。方海兰等[14]通过ITS条形码有效鉴别2个中国药典物种和8个同属植物的种子种苗。叶方等[15]对武当山区重楼属植物进行种内分子鉴定研究，其分析结果充分表明，ITS2序列可将不同品种重楼药材很好地区分开，并建议将宽叶重楼、狭叶重楼作为七叶一枝花的变型处理。刘涛等[16]通过中药材DNA条形码鉴定系统比对和NJ树鉴定，结果均表明psbA-trnH序列可区分滇重楼及其同属物种，且具有较好的稳定性和准确性，为保障临床用药安全提供了新的技术手段。
以上研究为重楼栽培品的比对分析提供了数据基础，本文在原有研究的数据基础上，对重楼样品的ITS和ITS2序列进行比对分析，确定了重楼栽培品中的10个品种，明确了重楼栽培中的混乱现象。重楼栽培品最终流向药材市场，导致市场上重楼药材的混乱，伪品与正品药材混淆难辨。通过本文的研究，可以体现重楼药材混伪品充斥市场的现象，为监管提出警示。DNA条形码技术为重楼属药用植物鉴别开辟了一条新途径，使不能从性状上进行准确鉴定的重楼样品依靠新的分子生物学手段或方法完成快速鉴定成为可能。
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