2018, Vol. 38 
盐酸西那卡塞(cinacalcet hydrochloride), 化学名为N-[(1R)-1-(1-萘基)乙基]-3-[3-(三氟甲基)苯基]丙-1-胺盐酸盐(化学结构式见图 1), 分子式:C22H22F3N, 相对分子质量:357.412, 是可作用于G-蛋白共轭型钙受体的二代拟钙剂[1-2], 临床上主要用于治疗慢性肾脏病透析患者的继发性甲状旁腺功能亢进以及甲状旁腺癌患者的高钙血症。盐酸西那卡塞最早由美国NPS Pharmaceuticals公司研发, 2004年3月FDA批准Amgen公司生产的西那卡塞片剂上市, 商品名Sensipar。2007年10月麒麟制药公司生产的西那卡塞片剂在日本上市, 2014年6月CFDA批准其在中国上市[3]。
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图 1 西那卡塞及其各杂质成分的化学结构式 Figure 1 Structures of cinacalcet and its impurities |
盐酸西那卡塞在片剂和血浆中的定量研究已有较多文献报道[4-7]。为了保证药品质量和临床用药的安全有效, 有必要建立一个全面、准确、高效的分析方法, 对其主成分及有关物质进行测定。本研究建立了盐酸西那卡塞原料药含量及杂质限量测定的HPLC方法, 并结合合成工艺[8-12]及已知杂质对照品, 分析研究包括起始原料、合成中间体、副产物及降解产物在内的10种有关物质。本试验依据相关指导原则进行了方法学验证[13-16], 有效地控制了盐酸西那卡塞原料药的质量, 也为其制剂的工艺优化提供参考依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪, LC solution色谱工作站(日本岛津公司); BP211D型分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司); Elmasonic S150实验室应用型超声波清洗器(德国Elma公司)。
1.2 试药盐酸西那卡塞原料药(批号:C130509-1、C130509-2、C130509-3)、盐酸西那卡塞对照品(由原料药精制而得, 经紫外、红外、质谱和核磁共振分析确证, 批号D130509, 纯度为99.7%)以及杂质对照品(杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I、J)由高瑞耀业(北京)科技有限公司提供, 各杂质对照品纯度均大于99.0%, 化学结构见图 1。乙腈、异丙醇为色谱纯, 三乙胺、磷酸二氢钾、磷酸为分析纯, 水为自制超纯水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱:Venusil XBP-C18柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm); 流动相:含0.5%三乙胺的30 mmol·L-1磷酸二氢钾水溶液(磷酸调节pH 2.5)-甲醇-乙腈-异丙醇(60:15:15:10), 等度洗脱; 流速1.3 mL·min-1; 进样量10 μL; 检测波长为220 nm; 柱温35 ℃。
2.2 溶液的制备 2.2.1 供试品溶液取样品适量, 精密称定, 用流动相制成每1 mL中含盐酸西那卡塞1 mg的溶液, 作为供试品溶液。
2.2.2 对照品溶液取盐酸西那卡塞对照品适量, 精密称定, 用流动相制成每1 mL中含盐酸西那卡塞1 mg的溶液, 作为对照品溶液。
2.2.3 杂质储备液取各杂质对照品适量, 精密称定, 用流动相制成每1 mL中含各杂质0.1 mg的溶液, 作为杂质储备液。
2.3 系统适用性试验取供试品溶液和杂质A~J的杂质储备液适量, 用流动相制成每1 mL中含盐酸西那卡塞0.5 mg、含各杂质5 μg的混合溶液, 取10 μL注入液相色谱仪, 记录色谱图, 结果见表 1及图 2。本试验实现了本品与10种杂质的基线分离。其中杂质F是主成分盐酸西那卡塞的同分异构体, 化学结构相似, 较难分离, 因此, 将杂质F与主峰的分离度作为系统适用性试验指标(分离度大于1.5)。
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表 1 系统适用性试验结果 Table 1 Results of specificity and system suitability test |
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1.盐酸西那卡塞(cinacalcet hydrochlorid) A~J.杂质(impurities) 图 2 系统适用性色谱图 Figure 2 Chromatogram of system suitability |
取供试品约10 mg, 置于10 mL量瓶中, 加流动相溶解并稀释至刻度, 摇匀, 制成供试品溶液, 按有关物质方法检查。取等体积流动相, 注入液相色谱仪, 进样分析, 记录色谱图。结果显示溶剂峰较小, 且出峰在1.5 min之前, 不影响有关物质的测定。
2.4.2 破坏性试验高温破坏:取供试品约10 mg, 100 ℃高温破坏24 h后, 置10 mL量瓶中, 用流动相溶解并稀释至刻度, 摇匀。
碱破坏:取本品约10 mg, 置10 mL量瓶中, 加3 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL, 静置10 h后, 加入相应浓度的盐酸溶液中和呈中性, 用流动相稀释至刻度, 摇匀。
酸破坏:取本品约10 mg, 置10 mL量瓶中, 加入3 mol·L-1的盐酸溶液1 mL, 放置4 h后, 加入相应浓度的氢氧化钠溶液中和呈中性, 用流动相稀释至刻度, 摇匀。
氧化破坏:取本品约10 mg, 置10 mL量瓶中, 加30%的过氧化氢溶液1 mL, 于100 ℃水浴加热2 h后, 用流动相稀释至刻度, 摇匀。
光照破坏:取光照试验10 d的样品约10 mg, 置10 mL量瓶中, 用流动相稀释至刻度, 摇匀。
湿破坏:取高湿试验10 d的样品约10 mg, 置10 mL量瓶中, 用流动相稀释至刻度, 摇匀。
精密量取上述溶液10 μL, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图。经氧化破坏后, 主要降解产物为杂质A; 经高温、碱破坏、酸破坏、光照破坏和湿破坏后相对稳定。强制降解试验后各杂质与主成分的分离度均符合要求, 表明该色谱方法专属性高。同时, 对样品进行物料平衡的计算, 经计算(以未经破坏样品的主峰为100%), 各种破坏后样品的主峰与杂质峰面积总和均在95%~105%范围内, 物料基本守恒。试验数据见表 2。
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表 2 物料守恒数据 Table 2 Material conservation data |
在研究过程中, 将破坏样品进行了DAD检测, 对主峰的纯度进行考察。结果显示, 各破坏条件下的主峰纯度及阈值均大于0.999 9。样品经破坏后, 没有产生与主峰保留时间一致的杂质, 此方法可以用于盐酸西那卡塞的有关物质测定。
2.5 线性关系的考察取盐酸西那卡塞对照品溶液及杂质储备液适量, 用流动相稀释制成0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0 μg·mL-1的溶液, 取上述溶液10 μL, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以浓度为横坐标(X), 峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线, 并按照斜率法计算各杂质的相对校正因子, 试验数据见表 3。结果显示, 盐酸西那卡塞及各已知杂质的浓度与峰面积呈良好的线性关系。
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表 3 回归方程、线性范围及校正因子 Table 3 Linear ranges, regression equations and correction factors |
取盐酸西那卡塞对照品溶液及杂质储备液适量, 用流动相溶解并稀释, 制成适当浓度的溶液进样分析, 以信噪比S/N=3为指标, 测得盐酸西那卡塞及各杂质的检测下限为5 ng·mL-1。
2.7 稳定性考察取供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件, 分别于0、1、2、4、8、12 h进样10 μL, 计算盐酸西那卡塞峰面积的RSD为0.51%, 最大未知杂质和总杂质峰面积的RSD分别为0.97%和1.5%, 说明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.8 精密度试验进样精密度:取供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件, 连续进样6次, 按峰面积计算其RSD。盐酸西那卡塞与杂质A峰面积的RSD分别为0.28%和0.50%, 其他已知杂质均未检出, 最大未知杂质和总杂质峰面积的RSD分别为0.85%和1.5%, 表明本方法重现性良好。
中间精密度:分别以不同人员、不同时间、不同仪器按重复性试验项下进样分析, 结果显示, 盐酸西那卡塞与杂质A峰面积的RSD均小于7%, 其他已知杂质均未检出, 最大未知杂质和总杂质峰面积的RSD均小于5%。表明本方法精密度良好。
2.9 重复性试验按“2.2”项下的供试品溶液制备方法, 平行制备6份供试品溶液, 并按“2.1”项下的色谱条件进样分析, 以峰面积计算其RSD。杂质A峰面积的RSD为3.5%, 其他已知杂质均未检出, 最大未知杂质和总杂质峰面积的RSD分别为1.9%和1.2%, 表明本方法重复性良好。
2.10 耐用性考察取供试品溶液, 通过改变“2.1”项下的色谱条件, 包括流速、柱温、色谱柱和检测波长, 考察对有关物质测定结果的影响。流速为(1.3±0.05)mL·min-1时, 杂质A、最大未知杂质和总杂质含量的RSD分别为0.28%、6.3%和2.0%;柱温为(35±5)℃时, 杂质A、最大未知杂质和总杂质含量的RSD分别为4.4%、4.2%和1.3%;在3种不同色谱柱条件下, 杂质A、最大未知杂质和总杂质含量的RSD分别为6.4%、2.5%和1.2%;波长为(220±2)nm时, 杂质A、最大未知杂质和总杂质含量的RSD分别为3.0%、4.2%和4.9%。其他杂质均未检出。试验数据表明, 色谱条件的变化对测定结果无显著影响, 即本方法具有良好的耐用性, 能够满足本品有关物质测定的要求。
2.11 样品检测精密量取供试品溶液适量, 用流动相稀释制成每1 mL中约含1 μg的溶液, 作为对照溶液; 取对照溶液10 μL注入液相色谱仪, 调节检测灵敏度, 使主成分色谱峰的峰高为满量程的10%~20%。再精密量取供试品溶液、对照溶液各10 μL, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图。结果见表 4。在3批试制样品中, 杂质A含量均小于0.1%, 其他9种杂质均未检出, 最大未知单杂均小于0.1%, 总杂质小于0.5%, 有关物质检测结果说明本产品的杂质少, 终产品质量高。
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表 4 样品检验结果 Table 4 Results of sample tests |
在流动相筛选试验中, 分别考察了水-甲醇、水-乙腈, 以及在此基础上加入三乙胺并调节不同pH, 发现采用水-甲醇为流动相时, 主峰拖尾严重, 而加入0.5%的三乙胺后, 峰形有较大的改善。此外, 还考察了缓冲液对分离的影响, 磷酸盐的效果优于有机酸, 且离子强度越大, 峰形越好。通过调节有机相与水相的比例, 可以改变流动相的洗脱能力, 但由于10种杂质的化学性质相差较大, 采用缓冲液-甲醇-乙腈的三元溶剂系统不能将主峰与杂质F基线分离, 通过试验发现, 异丙醇具有较好的分离效果, 最终确定了缓冲液-甲醇-乙腈-异丙醇的四元溶剂系统, 以等度洗脱的方式, 实现了主成分与10种杂质的基线分离, 避免了采用梯度洗脱方式带来的梯度峰对杂质检测的影响。方法学验证结果表明:本试验建立的方法分离效果好, 快速准确, 并具有良好的耐用性, 能满足有关物质检测的各项要求。
3.2 检测波长的选择采用岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪配置的UV-VIS检测器, 测得盐酸西那卡塞与其中6种杂质在220 nm波长处有最大吸收, 个别杂质在248、272 nm波长处有较强吸收, 综合考虑, 选用220 nm作为盐酸西那卡塞有关物质的检测波长。
3.3 有关物质检查运行时间的选择通过实际样品的检测, 发现在盐酸西那卡塞保留时间的3倍以后, 没有杂质峰出现, 且破坏性试验主要降解产物集中在主峰之前, 因此, 将有关物质检查的运行时间定为主峰保留时间的3倍, 保证测定结果的可靠性。
3.4 杂质分析及计算根据盐酸西那卡塞的化学性质、合成工艺、合成路线及降解途径, 并参考强制降解试验结果, 确定了本品可能存在的杂质有10种, 即杂质A((R)-1-(1-萘基)乙胺)为制备本品的起始原料; 杂质C(α-萘乙酮肟)为主成分的降解物; 杂质B(N-[1-(R)-(1-萘基)乙基]-3-苯基-1-丙胺)、杂质D(N-[1-(R)-(1-萘基)乙基]-3-三氟甲基苯甲胺)、杂质E(N-[1-(R)-(1-萘基)乙基]-3-(3-甲基苯基)-1-丙胺)均为合成过程的副产物; 杂质F(N-[1-(R)-(1-萘基)乙基]-3-(2-三氟甲基苯基)-1-丙胺)、杂质G(N-[1-(R)-(1-萘基)乙基]-3-(4-三氟甲基苯基)-1-丙胺)分别为主成分的邻位和对位异构体, 同样为合成过程的副产物; 杂质H(N-[1-(R)-[1-(7, 8-二氢萘基)]乙基]-3-(3-三氟甲基苯基)-1-丙胺)、杂质I(N-[1-(R)-[1-(5, 6-二氢萘基)]乙基]-3-(3-三氟甲基苯基)-1-丙胺)、杂质J(N-[1-(R)-[1-(5, 6, 7, 8-四氢萘基)]乙基]-3-(3-三氟甲基苯基)-1-丙胺)均为合成过程的副产物, 由中间体过度氢化还原而产生。各杂质化学结构如图 1所示。
根据10种杂质的校正因子, 可将其分为3类, 并按以下方式进行控制:
(1) 校正因子小于0.9的杂质:共3种, 即杂质A、B、C, 采用自身对照法测定, 其杂质控制更加严格, 更能保证产品的质量, 因此在单一杂质中以自身对照法计算[17]。
(2) 校正因子在0.9~1.1之间的杂质:共3种, 即杂质D、E、F, 可直接按自身对照法计算, 不影响测定的准确度。
(3) 校正因子大于1.2的杂质:共4种, 即杂质G、H、I、J, 如采用自身对照法测定, 其测定结果会低估了杂质含量, 但由于这4种杂质在实际的样品中含量极低, 均为未检出或接近未检出, 为简化试验, 无需按校正因子计算, 在单一杂质中以自身对照法计算即可。
4 结论本试验建立了一种有效检测盐酸西那卡塞原料药中有关物质的高效液相色谱法, 并对方法的有效性和检出能力进行了评价。该方法可以检出10种盐酸西那卡塞的杂质并能将其有效分离, 结果表明该方法简便、准确, 可以用于批量样品的质量检测, 为本品的质量控制奠定了基础, 也为制剂的质量研究提供参考。
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