2018, Vol. 38 
2. 哈尔滨工业大学可调谐(气体)激光技术国家级重点实验室, 哈尔滨 150080
2. National Key Laboratory of Science and Technology on Tunable Laser, Harbin Institute of Technology, Harbin 150080, China
食品安全是全球的一项重大问题, 快速识别和检测食品中存在的有害物质是食品检测中的一项重要任务。随着人民生活质量的逐渐提升, 牛奶已经成为现代人必不可少的食品, 因此对牛奶安全质量的监控管理显得尤为重要。在食品畜禽动物的饲料中适当添加抗生素, 可有效阻止肠道有害菌增殖, 使畜禽机体保持健康, 减少发病率, 但是抗生素的滥用给人们的身体健康带来威胁。例如大量或经常饮用含有抗生素的牛奶, 人体内抗生素超标, 会使侵入人体的细菌产生抗药性, 从而面临更大的健康威胁。因此, 建立牛奶中抗生素的检测方法在食品安全上有着重要意义。
环丙沙星属于喹诺酮类抗菌药物, 是目前广泛应用的抗生素之一[1]。当前, 国内外对于喹诺酮类抗生素残留的检测方法多有报道, 主要包括分光光度法[2], 高效液相色谱法[3], 液质联用法[4], 电化学法[5]和微生物法等[6]。由于上述检测方法都存在预处理过程烦琐、检验周期长、检测成本高、仪器昂贵等缺点, 因此严重限制了现场检测的推广和应用。针对上述问题, 本文提出利用表面增强拉曼光谱(SERS)技术检测牛奶中的环丙沙星, 该方法具有快速、准确、无损及操作简便等优点。
拉曼光谱可以检测样品中存在的化学物质及其相对含量[7-8], SERS技术不仅继承了常规拉曼光谱技术高特异性, 不受水的干扰, 支持多成分同时检测, 对样品无损毁等优点, 而且克服了拉曼光谱灵敏度低的问题[9-10]。随着便携式拉曼光谱仪的市场化, 常规拉曼光谱和SERS技术在食品[11-12]和药品[13-14]安全检测中的应用越来越广泛。虽然部分文献[15-17]利用SERS技术测定了环丙沙星, 但是主要是定性方面的研究, 很少有人开展过定量分析。本文基于SERS技术检测牛奶中的环丙沙星, 为牛奶中环丙沙星的现场、快速检测探索新的途径。
1 实验部分 1.1 实验材料硝酸银(国药集团化学试剂有限公司, 批号20110104, 含量≥99.8%); 抗坏血酸(阿法埃莎(中国)化学有限公司, 批号023269);柠檬酸钠(国药集团化学试剂有限公司, 批号20120118, 含量≥99.0%); 环丙沙星(上海源叶生物科技有限公司, 批号SM0325YG14, 含量≥98.0%); 硝酸(西陇化工有限公司, 批号1601161, 含量≥65.0%); 石英片购于南通瑞森光学科技有限公司; 实验中所用水均为18.2 MΩ超纯水。
1.2 银溶胶的制备按照文献[18]所述方法制备。在30 ℃水浴, 900 r·min-1搅拌的情况下, 向8 mL抗坏血酸(6.0×10-4 mol·L-1)和柠檬酸钠(3.0×10-3 mol·L-1)的混合溶液中加入0.1 mol·L-1硝酸银水溶液0.08 mL, 可观察到锥形瓶中液体由无色变为黄色, 最后至蓝色浑浊液体。15 min后, 将所得到的溶胶用4 ℃冰水稀释10倍, 得到实验所用银溶胶。制备过程中柠檬酸钠作为氧化剂, 抗坏血酸作为还原剂。
1.3 拉曼光谱仪及其检测条件本实验使用BWS415-785H型(B&W Tek, Inc.)便携式拉曼光谱仪采集光谱。激发光源为785 nm的二极管激光器, 光谱测量范围为68~2 700 cm-1, 光谱分辨率小于3 cm-1。使用焦距为6.8 mm的透镜汇聚光束, 聚焦后的光斑尺寸约为10 μm。实验中, 以疏水反光的铝箔胶带贴在载玻片上作为盛放检测物的平台, 控制仪器探头与铝箔胶带面垂直使激发光垂直入射, 取混合后样本20 μL滴在铝箔胶带上, 让激光焦点聚焦在液滴中心-铝箔胶带面处。本实验中激光器功率为50 mW, 积分时间均为10 s, 每个样品测定5次后取平均值, 如无特殊说明, 本文SERS均在此条件下检测所得。数据采集及光谱处理均采用光谱仪自带软件Bwram 1.01.20, 使用快速傅氏变换(FFT)平滑方法对采集到的光谱进行平滑处理, 并使用软件自带算法对光谱数据进行背景扣除。
2 结果和讨论 2.1 环丙沙星特征峰的归属及最佳实验条件环丙沙星的分子结构式如图 1所示。首先对环丙沙星的固体粉末进行常规拉曼峰的检测, 然后对100 μg·mL-1的水溶液进行了SERS检测, 如图 2所示。从图 2可以看出, 环丙沙星固体粉末的拉曼特征峰十分明显, 主要分布在1 029、1 384、1 459和1 625 cm-1处, 其中1 029 cm-1为C-H摇摆振动, 1 384为O-C-O对称伸缩振动, 1 459 cm-1为苯环振动, 1 625 cm-1为C=O伸缩振动[1]。在100 μg·mL-1水溶液的SERS检测中也可以清晰地观察到这些峰位。
|
图 1 环丙沙星分子结构式 Figure 1 Molecular structure of ciprofloxacin |
|
图 2 环丙沙星固体粉末拉曼光谱(a)和100 μg·mL-1水溶液SERS光谱(b) Figure 2 Normal Raman spectrum of ciprofloxacin solid powder(a)and SERS spectrum of 100 μg·mL-1 ciprofloxacin solution(b) |
可以通过添加适量的无机盐(促凝剂)改变溶胶中纳米颗粒稳定的分散状态, 集聚产生更多的SERS热点, 从而取得更好的增强效果[19-20]。对于不同的溶胶体系而言, 不同的无机盐对样品检测的增强效果有所差异。本研究经过多次实验发现, 环丙沙星牛奶溶液中盐酸的增强效果最好, 因此选取0.2 mol·L-1盐酸为促凝剂。混合顺序为环丙沙星牛奶溶液、银溶胶、盐酸, 体积比为3:3:1。
2.2 灵敏度和线性试验配制了质量浓度为500、350、200、100、50 μg·mL-1的环丙沙星牛奶溶液, 分别取此液5 mL于10 mL离心管中, 向其中滴入1 mol·L-1的盐酸15 μL作为蛋白质沉淀剂, 之后放入离心机中, 7 500 r·min-1离心10 min。分别取各种浓度的牛奶上清液30 μL、银溶胶30 μL与10 μL盐酸(0.2 mol·L-1)混合, 再取15 μL滴于铝箔胶带上, 对其进行SERS检测, 检测结果如图 3所示。从图 3可以看到, 当环丙沙星的牛奶溶液的质量浓度低至50 μg·mL-1时, 仍然可以观察到1 029、1 384以及1 625 cm-1等处的特征峰, 因此牛奶中检测下限约为50 μg·mL-1。
|
图 3 不同浓度的环丙沙星牛奶溶液的SERS光谱图 Figure 3 SERS spectra of ciprofloxacin in milk at various concentrations |
根据图 3的实验数据, 绘出了1 384 cm-1处的拉曼特征峰强度随环丙沙星牛奶溶液浓度的曲线, 如图 4所示。通过对数据拟合得到曲线方程:
Y=224.244 8+2.582 4X R2=0.939
|
图 4 环丙沙星牛奶溶液拉曼特征峰强度随其浓度的变化曲线 Figure 4 The relationship between the Raman intensity and the concentration of ciprofloxacin in milk |
为了验证本法的准确性以及可靠性, 采集3种加标质量浓度分别为150、300、400 μg·mL-1的样品进行了回收率的分析, 如表 1所示。由表 1可知, 回收率在92.7%~108.3%之间, RSD小于8.3%。
|
表 1 牛奶中环丙沙星的回收率及RSD Table 1 Recovery and RSD of ciprofloxacin in milk |
本文开展了基于SERS技术检测牛奶中环丙沙星的研究。环丙沙星的主要拉曼峰位于1 029、1 384、1 459和1 625 cm-1等处, 选取1 384 cm-1拉曼峰作为特征峰, 在最佳实验条件进行了SERS检测。结果表明, 环丙沙星牛奶溶液中检测下限约为50 μg·mL-1, 在1 384 cm-1拉曼特征峰处, 环丙沙星牛奶溶液特征峰强度与浓度的曲线方程为Y=224.2448+2.5824X, 线性相关系数为R2=0.939。同时, 对该方法的回收率进行了测试, 回收率范围在92.7%~108.3%之间, RSD小于8.3%。该方法具有快速、准确、无损及操作简便等优点, 在牛奶中环丙沙星的检测具有一定的应用潜力。
| [1] |
HE L, LIN M, LI H, et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy coupled with dendritic silver nanosubstrate for detection of restricted antibiotics[J]. J Raman Spectrosc, 2010, 41(7): 739. |
| [2] |
蔡卓, 甘宾宾, 李斯光, 等. 紫外可见分光光度法在抗生素类药物分析中的应用[J]. 化工技术与开发, 2007, 36(12): 24. CAI Z, GAN BB, LI SG, et al. Application of ultraviolet-visible spectrophotometry in analysis of antibiotics[J]. Technol Dev Chem Ind, 2007, 36(12): 24. DOI:10.3969/j.issn.1671-9905.2007.12.007 |
| [3] |
李小玲, 黄向荣, 万译文, 等. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星[J]. 中国渔业质量与标准, 2013, 3(4): 25. LI XL, HUANG XR, WAN YW, et al. Simultaneous determination of norfloxacin, ciprofloxacin and enrofloxacin residues in aquatic products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chin Fish Qual Stand, 2013, 3(4): 25. |
| [4] |
曹莹, 蒋音. 利用液质联用仪快速确证中兽药中的氟喹诺酮类药物[J]. 中国兽药杂志, 2012, 46(6): 27. CAO Y, JIANG Y. Rapid confirmation of fluoroquinolones in traditional Chinese medicine by LC-MS[J]. Chin J Vet Drug, 2012, 46(6): 27. |
| [5] |
高波. 分子印迹光学与电化学传感材料的制备与计算机模拟[D]. 长春: 吉林大学, 2015 GAO B. Preparation and Computational Simulation of Molecularly Imprinted Polymers with Optical and Electrochemical[D]. Changchun: Jilin University, 2015 |
| [6] |
吴琳羚, 毕亚萍, 李丹, 等. 微生物学检测技术在食品抗生素残留检测的研究应用[J]. 中国微生态学杂志, 2014, 26(5): 598. WU LL, BI YP, LI D, et al. Detection of antibiotic residues in food by microbiological detection technology[J]. Chin J Microecol, 2014, 26(5): 598. |
| [7] |
PETRY R, SCHMITT M, POPP J. Raman spectroscopy-a prospective tool in the life sciences[J]. Chem Phys Chem, 2003, 4(1): 14. DOI:10.1002/cphc.v4:1 |
| [8] |
KNEIPP K, KNEIPP H, ITZKAN I, et al. Ultrasensitive chemical analysis by Raman spectroscopy[J]. Chem Rev, 1999, 99(10): 2957. DOI:10.1021/cr980133r |
| [9] |
CAMPION A, KAMBHAMPATI P. Surface-enhanced Raman scattering[J]. Chem Soc Rev, 1998, 27(4): 241. DOI:10.1039/a827241z |
| [10] |
SCHLUCKER S. Surface-enhanced Raman spectroscopy:concepts and chemical applications[J]. Angew Chem Int Ed, 2014, 53(19): 4756. DOI:10.1002/anie.201205748 |
| [11] |
HUANG H, SHI H, FENG S, et al. Quick detection of traditional Chinese medicine 'Atractylodis Macrocephalae Rhizoma' pieces by surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Laser Phys, 2013, 23(1): 15601. DOI:10.1088/1054-660X/23/1/015601 |
| [12] |
布仁巴图, 韩斯琴高娃, 哈斯乌力吉, 等. 2种蒙药中硫磺的拉曼光谱测定分析[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(7): 1279. BUREN BT, HAN SQGW, HASI WLJ, et al. Detection of sulphur in 2 Mongolian medicines using Raman spectroscopy[J]. Chin J Pharm Anal, 2015, 35(7): 1279. |
| [13] |
ZHENG J, HE LL. Surface-enhanced Raman spectroscopy for the chemical analysis of food[J]. Compr Rev Food Sci Food Saf, 2014, 13(3): 317. DOI:10.1111/crf3.2014.13.issue-3 |
| [14] |
QIN J, CHAO K, KIM MS. Simultaneous detection of multiple adulterants in dry milk using macro-scale Raman chemical imaging[J]. Food Chem, 2013, 138(2): 998. |
| [15] |
郭志男, 陈雷, 王旭. 磁性分子印迹聚合物对环丙沙星的分离以及SERS检测[J]. 光谱学与光谱分析, 2010, 30(11): 235. GUO ZN, CHEN L, WANG X, et al. Ciprofloxacin separation with magnetic molecularly imprinted polymers(MIPs)and detection based on SERS[J]. Spectrosc Spect Anal, 2010, 30(11): 235. |
| [16] |
秦晓宇. 基于表面增强拉曼散射的几种抗生素药物检测研究[D]. 佳木斯: 佳木斯大学, 2015 QIN XY. Study on the Detection of Several Antibiotics Based on Surface Enhanced Raman Scattering[D]. Jiamusi: Jiamusi University, 2015 |
| [17] |
江欣. 几种基于半导体TiO2的表面增强拉曼散射研究[D]. 长春: 吉林大学, 2015 JIANG X. Investigations on Semiconductor-based TiO2 Surface-enhanced Raman Scattering[D]. Changchun: Jilin University, 2015 |
| [18] |
LEE PC, MEISEL D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols[J]. J Chem Phys, 1982, 86(17): 3391. DOI:10.1021/j100214a025 |
| [19] |
JANA NR, PAL T. Anisotropic metal nanoparticles for use as surface-enhanced Raman substrates[J]. Adv Mater, 2007, 19(13): 1761. DOI:10.1002/(ISSN)1521-4095 |
| [20] |
ZHANG ML, LIN X, ZHAO XR, et al. Rapid and simple detection of pethidine hydrochloride injection using surface-enhanced Raman spectroscopy based on silver aggregates[J]. Anal Methods, 2015, 19: 8241. |