2018, Vol. 38 
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室, 西宁 810008
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Qinghai Key Laboratory of Qinghai-Tibet Plateau Biological Resources, Xining 810008, China
唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.)为蓼科(Polygonaceae)大黄属(Rheum Linn.)多年生草本植物, 藏医称"君扎", 是《中华人民共和国药典》2015年版中规定的大黄药材的主要来源之一, 是青海省的道地药材之一[1-2]。唐古特大黄有效成分主要是蒽醌类衍生物, 包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚及其苷类, 具有较强的泻下, 抗病源微生物, 镇痛抗炎, 抗氧化抑酶, 保肝, 利胆, 降血脂, 抗衰老, 调节免疫的作用[1-4]。大黄为多途径的传统用药, 最近研究表明, 除泻下等传统功用外, 其所含大黄多糖还具有抗肿瘤, 抗衰老, 降低血糖, 抗辐射等多种药用价值[5-9]。多糖类成分已成为近年来中药天然药物研究领域中倍受关注的一类重要成分, 其药理作用广泛, 独特的活性和低毒特点在临床应用中具有极大的潜力[10-15]。
对不同药用植物的研究表明, 植物因为生长年限、生长环境的不同, 其有效成分的积累动态有所不同[16-17]。本研究以青海省湟中县群加乡、西宁市廿里铺镇、湟源县东峡乡栽培唐古特大黄为研究对象, 用苯酚-硫酸比色法测定根中大黄多糖含量, 高效液相色谱法测定蒽醌含量, 探究多糖和蒽醌含量年际和月际的变化特征, 为道地药材唐古特大黄有效成分的动态积累、质量控制、种植栽培及资源的充分利用提供一定的科学依据。
1 材料和方法 1.1 植物材料栽培唐古特大黄种子2001年9月采集于青海省果洛州达日县境内, 于2002年5月人工播种于3个种植地(表 1):青海省湟中县群加乡、青海省西宁市廿里铺镇、青海省湟源县东峡乡。样品采集自栽培2年开始, 生长季每月中旬采集1次。年际动态选择了生长季末期10月中旬的样品, 月际动态选择了5年生5~11月每月中旬采集的样品。样品由中国科学院西北高原生物研究所周国英研究员鉴定为唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.)。
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表 1 唐古特大黄3个样地地理位置及生境条件 Table 1 Habitats and envioromental conditions of three planting samples |
Cary 300 Bio型紫外-可见分光光度计(美国Varian公司); 优普UPT-Ⅱ-20L型超纯水机(上海优普实业有限公司); TGL-16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
Agilent 1260型高效液相色谱仪(包括G1311C Quat Pump VL、G1329B ALS、G1316A TCC、G1315D DAD VL); Agilent色谱工作站; R1001-VN型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司); KQ5200DE型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司); Sartorius AG CP224s精密电子天平(精度±0.000 1 g); Mettler Toledo XS105精密电子天平(精度±0.01 mg)。
对照品:D-无水葡萄糖(批号10833-200904)、芦荟大黄素(批号110795-201007)、大黄酸(批号110757-200206)、大黄素(批号110756-200110)、大黄素甲醚(批号110758-201013)和大黄酚(批号110796-201118)购自中国食品药品检定研究院, 纯度均在98%以上。
有机溶剂包括石油醚、无水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、甲醇、冰乙酸、盐酸(分析纯, 天津市百世化工有限公司); 苯酚(分析纯, 陕西亿农高科药业有限公司); 浓硫酸(分析纯, 甘肃白银化工有限公司); 甲醇(色谱纯, 山东禹王实业有限公司化工分公司)。
1.3 苯酚硫酸法测定多糖含量 1.3.1 对照品溶液制备和标准曲线绘制精密称取105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品10 mg, 置100 mL量瓶中, 加适量水溶解, 并稀释至刻度, 摇匀, 即得0.1 mg·mL-1的D-无水葡萄糖溶液。实际配得质量浓度为0.102 0 mg·mL-1的D-无水葡萄糖对照品溶液。
分别精密移取上述D-无水葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL, 分别置25 mL具塞试管中, 加蒸馏水补至2.0 mL, 摇匀, 依次加入5%苯酚溶液1.0 mL混匀后, 缓慢加入浓硫酸5.0 mL, 摇匀后冷却至室温, 进行显色反应, 以2.0 mL蒸馏水作为空白对照, 在490 nm进行紫外分光光度法测定。以D-无水葡萄糖对照品溶液的浓度C(mg·mL-1)为横坐标, 对照品溶液的吸收度值A为纵坐标, 绘制标准曲线, 计算其标准曲线回归方程:
Y=13.666X+0.049 3 r=0.999 1
1.3.2 供试品溶液制备称取2份样品粉末(过40目筛)0.500 g, 精密称定(精确到±0.001 g), 置于100 mL圆底烧瓶中, 加石油醚100 mL, 加热回流30 min, 过滤。待滤纸上挥干溶剂后, 将滤渣转移入三角烧瓶中, 用装有75%乙醇的洗瓶冲洗滤纸上的剩余残渣, 继续加入75%乙醇至约100 mL, 160 W、40 kHz、30℃条件下超声30 min, 过滤。滤渣与滤器用75%乙醇30 mL分次洗涤, 除去滤液和洗涤液, 用蒸馏水将滤渣冲洗入三角烧瓶中, 加水150 mL, 置于加热板上加热30 min, 冷却至室温后, 过滤。将滤液转移入250 mL量瓶中, 并用少量蒸馏水洗涤滤器3次, 将洗涤液也转移至上述量瓶中, 加水稀释至刻度, 摇匀, 精密移取3 mL, 加Sevage试剂[三氯甲烷-正丁醇(5:1)]3 mL, 剧烈振荡使其充分混合, 在9 000 r·min-1转速下离心5 min, 弃去中间变性蛋白层和下层有机层, 水相继续重复上述操作直至水相与有机相中间无变性蛋白出现为止, 移取所有上清液, 留存作为供试品溶液。
1.3.3 供试品溶液测定将上述供试品溶液稀释10倍(精密移取供试品溶液1.0 mL置10 mL量瓶中, 加水稀至刻度, 摇匀), 精密移取该溶液0.5 mL置25 mL具塞试管中, 加蒸馏水补至2.0 mL后依次加入5%苯酚溶液1 mL, 混匀, 缓慢加入浓硫酸5 mL, 摇匀冷却至室温后进行显色反应, 紫外分光光度仪在490 nm波长处测定其吸收度。从标准曲线上读出供试品溶液中含有的D-无水葡萄糖浓度, 再根据稀释情况进行计算。同时做空白实验以排除滤纸对实验结果的干扰。
1.3.4 大黄粗多糖制备和换算因子的确定称取已干燥粉碎好的样品粉末(过40目筛)10 g, 加蒸馏水200 mL, 置加热板加热煮沸1 h; 过滤, 滤液在60℃真空浓缩至约20 mL左右, 分成2份, 按比例1:4加Sevage试剂40 mL, 剧烈振荡使其充分混合, 在4 000 r·min-1转速下离心5 min, 弃去中间变性蛋白层和下层有机层, 水相继续重复上述操作直至水相与有机相中间无变性蛋白出现为止。剩余液体按比例1:4加无水乙醇沉淀, 置冰箱中冷藏24 h。次日过滤, 除去滤液, 沉淀置于研钵中依次用90%乙醇、无水乙醇和丙酮各洗涤3次, 直至成粉末状。在60℃真空干燥至恒重, 即制得大黄粗多糖粉末。
精密称取干燥至恒重的自制大黄粗多糖粉末约10 mg, 置于25 mL量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀, 得自制粗多糖样品溶液。根据实际情况取用一定量多糖溶液置25 mL具塞试管中, 加蒸馏水补至2.0 mL, 摇匀。按"1.3.1"项下的方法测定吸收度, 由回归方程计算出样品溶液中葡萄糖浓度, 按换算因子f=m/C·D[式中:m为称取大黄多糖的质量(mg), C为多糖液中D-无水葡萄糖的浓度(mg·mL-1), D为多糖的稀释倍数]计算, 结果为1.442。
1.4 高效液相色谱法测定蒽醌含量 1.4.1 色谱条件色谱柱为Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm); 流动相A为甲醇, B为0.1%乙酸溶液, 梯度洗脱(0~20 min, 60%A→80%A; 20~40 min, 80%A→95%A; 40~45 min, 95%A); 体积流量1.000 mL·min-1; 柱温25℃; 检测波长254 nm。
1.4.2 混合对照品溶液和供试品溶液的制备精密称取对照品芦荟大黄素1.10 mg, 大黄酸0.60 mg, 大黄素1.12 mg, 大黄素甲醚1.24 mg, 大黄酚0.55 mg, 甲醇溶解, 定容至25 mL, 制成含芦荟大黄素44 μg·mL-1, 大黄酸24 μg·mL-1, 大黄素44.8 μg·mL-1, 大黄素甲醚49.6 μg·mL-1, 大黄酚22 μg·mL-1的混合对照品溶液。
取本品粉末(过4号筛)约0.150 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇25 mL, 称量, 加热回流1 h, 放冷, 再称量, 用甲醇补足损失的量, 摇匀, 滤过; 精密量取续滤液5 mL, 置烧瓶中, 挥去溶剂, 加8%盐酸溶液10 mL, 220 W、40 kHz、30℃条件下超声处理2 min, 再加三氯甲烷10 mL, 加热回流1 h, 放冷, 置分液漏斗中, 分取三氯甲烷层, 酸液再用三氯甲烷提取3次, 每次10 mL, 合并三氯甲烷液, 减压回收溶液至干, 残渣加甲醇使溶解, 转移至10 mL量瓶中, 取续滤液, 过0.45 μm微孔滤膜, 即得。
1.4.3 方法学考察回归方程:吸取"1.4.2"项下的混合对照品溶液2、4、6、8、10、12、16 μL, 按照"1.4.1"项下的色谱条件进样测定, 拟合峰面积(Y)和进样量(X, μg)做回归曲线, 得回归方程。
稳定性试验:分别在0、2、4、6、8、16、24 h和连续5 d, 精密吸取"1.4.2"项下的同一混合对照品溶液10 μL进样测定, 结果表明24 h内和5 d内对照品稳定性良好。
精密度试验:精密吸取"1.4.2"项下的混合对照品溶液10 μL, 连续测定6次, 结果表明仪器及进样精密度良好。
重复性试验:取同一样品(湟中县群加乡5年生样本)6份, 分别制备供试品溶液进行测定, 结果表明方法重复性较好。
加样回收率实验:精密称取已测知含量的大黄根粉末0.150 g, 分别精密加入相当于样品中5种蒽醌含量的80%、100%、120%的对照品溶液, 按"1.4.2"项下方法制备供试溶液, 精密吸取10 μL进样测定, 计算回收率。
蒽醌方法学考察结果见表 2。
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表 2 蒽醌方法学指标 Table 2 Methodology of anthraquinone |
精密称取各样品粉末约0.150 g, 按照"1.4.2"项下的方法制备供试品溶液, 按照"1.4.1"项下的色谱条件注入液相色谱仪进行测定, 每批平行测定3次, 记录色谱峰面积, 用标准曲线计算含量。混合对照品和样品色谱图见图 1。
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1.芦荟大黄素(aloe emodin) 2.大黄酸(rhein acid) 3.大黄素(emodin)4.大黄素甲醚(physcion) 5.大黄酚(chrysophanol) 图 1 混合对照品(A)和样品(B)色谱图 Figure 1 Chromatograms of mixed reference standards(A)and sample(B) |
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表 3 不同地点唐古特大黄多糖年际含量(%, n=3) Table 3 Annual change of polysaccharides content in Rheum tanguticum from different habitats |
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表 4 不同地点唐古特大黄多糖月际含量(%, n=3) Table 4 Monthly change of polysaccharides content in Rheum tanguticum from different habitats |
由表 3可知, 唐古特大黄多糖在不同的种植地均表现出明显的年际变化动态特点:湟中县群加乡、湟源县东峡乡2年生至9年生的栽培唐古特大黄多糖年际含量呈现出"M"字型的变化趋势。群加乡和东峡乡栽培唐古特大黄在2年生时多糖含量接近(5.01%和4.88%), 并且在3年生时达到第1个高峰值(6.98%和6.43%), 多糖含量随着年限的增长而下降, 并在6年生(群加乡, 4.23%)和5年生(东峡乡, 4.62%)时达到低峰值, 随后多糖含量随着年限的增长而增长, 并在8年生(群加乡, 7.34%)和7年生(东峡乡, 5.90%)时达到第2个高峰值, 在9年生时都达到低峰值(4.87%和3.96%)。廿里铺3年生时含量为8.35%, 在5年生时下降为4.62%, 7年生时上升为7.94%, 变化规律呈"V"字型。
由表 4可知, 唐古特大黄多糖在不同的种植地也表现出明显的季节变化动态特点:5年生的群加乡、廿里铺、东峡乡栽培唐古特大黄从5月份到11月份的大黄多糖季节含量呈现出"W"字型的变化趋势。5月份采挖的大黄中, 廿里铺多糖的含量最高; 群加乡和廿里铺的大黄多糖含量在6月份, 东峡乡的大黄多糖含量在7月份分别降至5~11月份中的最低。随后, 群加乡和廿里铺的大黄多糖含量在8月份, 东峡乡的大黄多糖含量在9月份分别升至5~11月份中的另一高峰值, 并都在10月份降至5~11月份中的第二低值, 并在11月份含量又出现了回升。
2.2 唐古特大黄蒽醌年际和月际变化特征|
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表 5 不同地点大黄蒽醌年际含量(%, n=3) Table 5 Annual change of anthraquinones content in Rheum tanguticum from different habitats |
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表 6 不同地点大黄蒽醌月际含量(%, n=3) Table 6 Monthly change of anthraquinones content in Rheum tanguticum from different habitats |
由表 5可知, 群加乡、东峡乡2年生至9年生的栽培唐古特大黄蒽醌年际含量呈现出"N"字型的变化趋势, 廿里铺3年生至7年生的栽培唐古特大黄多糖年际含量呈现出倒"V"字型的变化趋势。3个不同种植地的栽培唐古特大黄在2~5年期间随着年限的增长, 蒽醌含量随之增长; 在5~7年间含量下降, 7~9年间增长。唐古特大黄的蒽醌含量在生长5年左右时达到高峰, 尽管在9年左右时出现第2个高峰, 但考虑生产成本, 生长5年采挖较为适宜。
由表 6可知, 唐古特大黄蒽醌季节动态变化也有明显的特点, 含量在5~11月份期间的变化趋势基本一致, 呈现出接近三峰变化趋势。在植物返青及生长初期的5~6月份间先上升, 6月份初含量达到最高; 在生长旺盛期(花果期)7~9月份呈明显下降趋势, 9月份达到最低水平; 10月份又略有回升; 11月份又略有下降。由此可见, 唐古特大黄的最佳采挖季节在生长初期的6月份和生长季结束的10月份。
3 讨论 3.1 栽培地点的选择栽培地点的选择是影响唐古特大黄品质的一个重要因素。唐古特大黄自然生境分布海拔为2 800~4 700 m, 东峡乡和群加乡海拔分别为2 970 m和2 857 m, 廿里铺为2 297 m。唐古特大黄喜凉爽、湿润和富有腐殖质的土壤, 是耐寒喜阴温的多年生草本, 就我们选择的3个种植地而言, 群加乡和东峡乡的海拔和土壤有机质要高于廿里铺, 而廿里铺的3、4、6、7年生的大黄多糖含量要高于另外两地, 但就5年生的季节含量来说, 三地的含量并无明显高低。推测可能是因为唐古特大黄多糖和蒽醌成分含量并非简单受海拔、土壤有机质含量等个别因素影响, 而是不同生境代表的温度、湿度、光照条件、土壤构成以及海拔、经纬度代表的环境条件综合作用的结果, 其中生境条件尤为典型。
3.2 含量波动与采集时间数据表明, 在不同的种植地, 唐古特大黄根多糖和蒽醌含量随植物的生长发育节律波动, 且表现出基本一致的动态变化规律。大黄的生长期只有150~160 d, 一般生长到3~4年开始开花、结实。4月份底或5月份初开始生长, 7~10 d叶子展开; 5月份中旬抽花茎, 6月份中旬左右开花, 持续约1个月, 7月份中下旬种子全部成熟, 随后, 茎秆开始枯萎, 8月份下旬完全枯死。10月份上旬第1次霜降以后, 簇生叶部分枯黄, 10月份下旬植株地上部分完全枯死, 根茎部形成越冬芽, 待来年长出新植株[16]。至此, 大黄的生长期结束。
多糖为植物初级代谢产物, 其规律波动间接反映了植物生长过程中的代谢变化, 并可能与植物自身的自我保护相关联。在大黄生长3年以后, 开始开花结果, 进入繁殖期, 此后几年多糖为供应繁殖, 分解大于合成, 含量发生了下降, 随着年限的推移, 地上部分越来越茂盛, 光合作用速率变强, 多糖逐渐积累, 含量又出现了上升。
唐古特大黄根部多糖的含量在6~7月份达到最低, 6~7月份为唐古特大黄花果期。多糖含量下降很可能是因为在植株形成花和种子期间, 分解代谢较为旺盛, 多糖作为初级代谢产物, 为植物传粉、繁衍后代或者其他生理功能提供了能量而分解。唐古特大黄于8~9月, 植株地上部分生长基本停滞, 植物生理活动减弱, 新陈代谢相对降低, 同化作用占据了主要代谢过程, 植物主要进行根及根茎部分的营养储存, 生长增大, 多糖含量在这个时期发生了增长。而在9月份之后含量下降, 可能是气温降低及日照时间缩短而造成的光合作用速率降低所致。10月份植物生长完全停滞后, 地上部分枯萎, 植物地上部分营养成分向根部运输, 地上部分的多糖也向根部累积, 致使根部多糖含量增高; 另一方面, 10月份多糖含量出现的增加趋势在生理上可能与植物的抗寒性相关联。
蒽醌的动态变化, 与他人研究结果相似或接近。曹纬国[7]等曾对1~4年生的唐古特大黄蒽醌含量进行比较, 得到蒽醌衍生物的含量随生长年限的增加而增加的结论。李锦萍[17]曾对相同地点采集的唐古特大黄根蒽醌含量季节动态变化进行研究, 结果显示, 6年生5~10月份按月采集的大黄根蒽醌变化规律呈现"N"字型。车国冬[4]等研究表明, 3年、4年生唐古特大黄总蒽醌含量在5~6月份生长初期增加, 并于6月份初达到最大值, 6~9月份生长旺盛期间明显降低, 10月份又略有回升。蒽醌作为次级代谢产物, 变化特征与5~10月份的多糖(初级代谢产物)恰好相反, 可以从某种角度印证了次级代谢产物是以初级代谢产物为前体的。而章英才[11]对3年生5、7、9、11月份宁夏六盘山掌叶大黄根进行多糖变化规律研究时发现, 从5月份至9月份根大黄多糖含量逐渐增高, 9月份达到最高值, 而11月份又有一定程度的下降, 与本实验得到的趋势略有不同, 原因有待进一步研究。
综合分析可知, 在3个种植地, 来源相同的唐古特大黄呈现出基本一致的年际和季节动态变化特征, 这与植物自身的遗传机制有关, 而外界环境因子也是多糖和蒽醌含量波动的重要因素。
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