2018, Vol. 38 
2. 中山大学药学院, 广州 510006
2. School of Pharmaceutical Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China
心脏毒性是药物临床使用过程中退市的主要原因, 所占比例高达33%, 其中大约一半是心律失常[1], 包括QT间期延长和致命的尖端扭转型室性心动过速(Torsade de Pointes, TdP), 为此, FDA和制药行业在新药上市之前都制定了强制性的药物心脏毒性筛选指南。现有的临床前心脏安全药理学评价主要是依据人用药品注册技术国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirement for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, ICH)制定的关于心脏安全评估框架性指南S7A/B, 其评估心率失常的方法是体外条件下检测药物是否阻滞人胚胎肾细胞(human embryonic kidney, HEK)中hERG(human Ether-a'-go-go-Related Gene)编码的钾通道介导的延迟整流钾电流(IKr)[2]。然而所述细胞系不具备心肌细胞的生物化学特性, 反映的只是药物与脱离生理环境的通道蛋白作用。同时, 由于心脏电生理受到多种离子通道的调节, 评价单个离子通道阻断作用已经证实不能完全评价QT间期延长, 仅检测阻滞hERG电流的筛选方法可能产生假阴性[3](即Alfuzosin)和假阳性[4](即Verapamil)结果。使用动物心脏作为人类心脏的替代模型功能也很有限, 因为鼠, 犬、兔的心脏结构, 电生理学和遗传学的种属差异, 也不能准确预测潜在心脏毒性[5]。
新的心脏毒性评价策略——综合性离体致心律失常风险评估(comprehensive in vitro proarrhythmia assay, CiPA)应运而生, 这是一种基于人类机制的、研究药物对人类心脏多个离子通道影响, 应用计算机模拟技术以及人源化细胞系的全新评价策略[6]。由于人诱导多能干细胞分化获得的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs)是人源细胞, 是最接近体内生理状态的体外细胞, 克服了种属间差异, 而且可以结合基因编辑或3D打印等技术, 为疾病机制的探讨、毒理学评价和其他生理学研究等提供了理想的工具。应用hiPSC-CMs可以减少不必要的动物实验, 同时可以高通量评价药物对心脏功能性和结构性的影响[7], 特别是在药物开发后期预测QT间期延长的风险, 为更加高效的药物筛选和临床前评价提供了一个良好的平台。
1 iPSCs介绍以及心肌细胞分化2006年, Takahashi和Yamanaka利用逆转录病毒将4种特异性转录因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4, 也被称为Yamanaka因子)转导到终末分化的小鼠成纤维细胞中, 成功建立了第1个诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)[8]。诱导多能干细胞具有独特的功能特征, 例如自我更新和多向分化的能力。他们还发现这些iPSCs不仅在细胞形态、生长特性、干细胞的标志物表达等方面与胚胎干细胞几乎完全相同, 而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质的状态、形成嵌合体动物等方面也与胚胎干细胞相似。目前已经证实诱导多能干细胞具有分化成向多种细胞的能力, 如心肌细胞、神经元细胞、干细胞、胰岛B细胞等, 因而具有巨大的临床应用价值。此后不久, 人类体细胞被成功重编程为iPSCs, 并在几年内开发了各种不同的iPSCs技术和应用[9-11], 这些创新在医学领域具有诱人的前景。由于iPSCs具有多能干细胞的独特特征, 使其成为药物筛选、细胞治疗、疾病研究的非凡工具。自从iPSCs首次生成以来, 在过去的10年里, iPSCs的研究现在跨越了全球各个领域。由于iPSCs携带患者疾病相关的遗传基因, 因此iPSCs是医学研究的理想工具。目前已有科学家利用疾病特异性iPSCs衍生的心肌细胞建立疾病模型[12], 这些模型可以改变我们对疾病机制的理解, 并有可能产生新的治疗策略。
iPSCs诱导的经典方法是使用逆转录病毒在鼠成纤维细胞中通过Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 4个转录因子进行强制表达; Oct3/4、Sox2是胚胎以及胚胎干细胞早期维持多能性因子, 而Klf4、c-Myc能促进胚胎干细胞增殖[8], 然而, 研究人员发现, 这2个基因在癌细胞中高度表达, 同时c-Myc有形成肿瘤的风险[13], 这些转录因子需要慢病毒或者逆转录病毒携带, 并且随机整合的方法可能会造成内源基因表达以及未知突变[5]。目前已经开发了使用非整合病毒[14]、附加型质粒[15]、合成修饰的mRNA[16]或重组蛋白的转基因插入方法[17], 消除了逆转录病毒介导的iPSCs基因组异常的担忧。Seki等[18]通过T细胞和仙台病毒载体获得了iPSCs, 该方法不仅快捷(不超过30 d), 更重要的是, 由于仙台病毒是非常有效的T细胞感染剂, 并且不会整合到宿主基因组中, 提供了更为有效安全的方法。
为了推动iPSCs应用于心血管领域的基础研究和临床治疗, 将iPSCs分化成心肌细胞的方法也不断得到改进。众所周知, 诱导多能干细胞可以自发分化并产生包括心肌细胞在内的3个胚层来源的细胞[8]。一种常用的iPSCs分化方法是通过悬滴和悬浮培养方法, 形成拟胚体(embryoid body, EB), 然后通过不同的诱导液, 于拟胚体贴壁分化14 d后, 利用CD 271磁珠分选, 在贴壁分化的胚体外周区域可以见到分化的心肌细胞。通过形态学染色和免疫化学染色, 可见心肌细胞特有的横纹肌结构等, 同时, RT-PCR检测表明心肌细胞相关的基因也都表达阳性[19]。
通过科学家们的不断尝试已经产生了很多提高心肌细胞分化效率的方法。卡特曼等证实, 在分化过程中加入调节关键信号通路的分子, 如BMP4[20]、激活素A(activin A), SB431542[21] (SB)、曲古抑菌素A[22]、抗坏血酸[23]皆可促进胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)和iPSCs分化为心肌细胞。另外, 针对临床治疗的需要, 已经有使用成分明确的培养基将hESCs和hiPSCs高效分化为心肌细胞。然而, iPSC-CMs分化产物中不仅含有心肌细胞, 而且还含有非心脏细胞类型, 包括成纤维细胞, 平滑肌细胞和内皮细胞[24]。移植低纯度的心肌细胞不仅可能引起心律失常, 更有可能造成畸胎瘤的风险。虽然iPSCs细胞的基因修饰以及使用激光显微镜进行手动分离已用于纯化过程, 但是这些方法耗时而且需要昂贵的设备[25]。目前已有使用具有整合和表面功能化的微流体鱼网状结构装置, 用于捕获特定的细胞。借助流动推导表面模式, 溶液中的细胞被迫穿过鱼网状结构, 实现目标细胞的高效选择性保留。将hiPSCs和hiPSCs衍生的心肌细胞的悬浮液用于验证装置功能。研究发现hiPSCs捕获率可以达到80%以上, 同时回收心肌细胞的速率显著提高而不影响细胞活力[26]。另一种纯化心肌细胞的方法是利用心肌和非心肌细胞之间代谢需求的差异性。在乳酸富集和无糖培养基中培养细胞, 1周即可非常有效筛选出心肌细胞[27]。
2 hiPSC-CMs特点为了将hiPSC-CMs应用于基础研究和临床应用, 例如将其用于疾病建模、药物筛选和再生医学, 首先需要阐明其生理学特性。来源于hESCs和hiPSC-CMs的心肌细胞表达肌丝蛋白并具有与原代心肌细胞类似的电生理特性[28]。这些细胞表达心脏离子通道, 产生类似于心房样、心室样和窦房结样动作电位(action potential, AP)。hiPSC-CMs的总体基因转录水平与人心肌细胞最为接近, 表明hiPSC-CMs可用于药理学及毒理学评价。使用免疫荧光和激光共聚焦显微镜证实肌节蛋白的表达[29]。iPSC-CMs表达心脏特异性结构基因, 例如编码肌节的肌丝蛋白包括ACTC1(α肌动蛋白1)、MYL2(肌球蛋白调节光链2)、MYH6(肌球蛋白重链6, α)和MYH7(肌球蛋白重链7, β)[30]。然而hiPSC-CMs与人心肌细胞相比也有一些区别, 如表达更高表达水平的KCNH2和HCN4。相反, KCNJ2表达水平更低。同时, hiPSC-CMs表达更低水平的SCN1B和ABCC9, 进而影响对INa和IKATP的药理学反应[31]。另外, hiPSC-CMs表现出固有的与心肌细胞类似的动作电位和Ca2+。给与地尔硫卓处理后, 显著缩短复极30%、90%时的动作电位时程APD30、APD90(action potential duration), 虽然并不影响APD30-90。同样, 对于hERG/IKr阻断剂E-4031, 量效依赖性模式地延长APD30和APD90[32]。这也说明hiPSC-CMs AP的变化波形与已知临床相关的药理学效应相同。这些研究表明, hiPSC-CMs将可能成为药物心脏毒性筛选的有效工具。
3 药物筛选许多研究人员已经将hiPSC-CM和hESC-CM用作药物开发过程中致心律失常的化合物筛选模型[33]。心肌细胞的同步自发节律性搏动是大多数体外评估心脏特异性功能的方法。有报道发现多电极阵列(multi-electrode array, MEA)系统结合hiPSC-CMs作为高通量筛选平台可以实时监测并诊断细胞毒性, 同时通过分析心肌细胞的搏动频率来监测心肌细胞的功能改变。与传统的体外心脏毒性检测指标相比, MEA能更早、更准确地发现心脏毒性[34]。Agnes等[35]用基于阻抗的生物分析方法证实了hESCs细胞和hiPSC-CMs细胞预测心肌毒性的一致性。以hiPSC-CMs为细胞模型, 评估心脏毒性的经典药物——阿霉素所致的心脏毒性。结果发现微摩尔级浓度的阿霉素会抑制hiPSC-CMs电生理活动, 纳摩尔级浓度的阿霉素会抑制细胞活力, 并造成线粒体功能障碍。使用MEA技术, 发现阿霉素显著改变hiPSC-CMs的电生理学性质, 同时以时间和剂量依赖性模式减小搏动振幅, 增加心律, 缩短场电位时程(field potential duration, FPD)。值得注意的是, 在低至0.25μmol·L-1的剂量下, 阿霉素所致的心脏毒性作用依然可以由MEA检测到并且在给药后立即出现。这也说明MEA是研究药物毒性的高度敏感工具。另一方面, MEA下的FP记录要求hiPSC-CMs每个细胞与相邻细胞紧密连接。场电位持续时间(FPD)的变化被认为对应于心脏的AP持续时间(APD)的变化, 也就对应于心电图(electrocard-iogram, ECG)中心室去极化/复极化(QT)间隔中的参数的变化[36]。因此, 基于MEA技术的FP可能与ECG测量相当。这也证明hiPSC-CMs可能与人类心脏具有相似的电生理特性, 表明hiPSC-CMs可能有望预测致心律失常性潜能。这将是药物开发的一个重要进步。
hiPSC-CMs表达心脏特异性因子和结构蛋白, 为心脏毒性评价提供了替代模型[33]。在临床前和临床研究中, 肌钙蛋白(cTnT和cTnI)已被用作检测阿霉素诱导的心脏损伤的高度敏感的血浆生物标志物。然而, 肌钙蛋白和许多其他心脏生物标志物仅在心脏组织损伤后才在血浆中显示水平升高, 同时具有有限的半衰期[37]。研究人员以hiPSC-CMs为心脏替代模型, 结合RNA-seq技术, 发现miR-187-3p、miR-182-5p、miR-486-3p、miR-486-5p表达下调, miR-182-5p、miR-4423-3p以及miR-34c-5p表达上调, 猜想miRNA可能参与调节心脏收缩功能。关键是, 在乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)等细胞毒性标志物出现之前, miRNA就有显著性变化, 而这些miRNA在患心力衰竭的患者和动物模型中皆表达上调[38]。因而阿霉素诱导的hiPSC-CMs miRNA失调可用作心脏毒性早期敏感的生物标志物, 可用于筛选具有相似作用机制的潜在药物和环境毒物。
4 构建心血管疾病模型hiPSC技术可以模拟遗传性心脏疾病的异常表型, 为研究疾病机制, 优化患者护理(个性化医疗)提供了新思路。利用患者特异性hiPSC-CMs可以呈现扩张型心肌病、肥厚型心肌病、长QT综合征等心血管疾病表型[5]。疾病特异性hiPSC-CMs为模拟人类疾病和个体化治疗提供了新的范例。长QT综合征(long QT syndrome, LQTS)是由心脏离子通道功能异常引起的家族遗传性单基因遗传疾病, 其特征在于心电图中QT间期延长。LQTS患者面临由于致命的室性心律失常而引发心源性猝死性风险。已经鉴定出至少12种LQT综合征的亚型, 迄今为止, hiPSC-CMs已被用于模拟LQT综合征类型1、2、3和8[39]。
Itzhaki等[40]利用LQTS 2患者(KCNH2基因中的A614V错义突变)的疾病特异性iPSC-CMs, 与健康对照细胞相比, 发现LQTS iPSC-CMs具有LQTS特征性的电生理学特征, 其动作电位持续时间(APD)显著延长。同时电压钳研究结果证实, 这种动作电位持续时间的延长源于心肌钾电流IKr的显著降低。重要的是, LQTS衍生的细胞表现出显著的致心律失常性, 表现为早期后去极化(early after depolarization, EAD)和触发性心律失常。因为LQTS心律失常往往是由阻断IKr所致, 给予IKr阻断剂E-4031或西沙必利皆大幅延长APD, 同时EAD也变得复杂。考虑到Ca2+内流促进APD和EAD, 钙离子通道阻断剂硝苯地平改善了LQTS iPSC-CMs的生理功能, 包括消除EAD, 显著缩短FPD, 缓解LQTS心脏组织模型的心律失常现象[41]。
5 细胞治疗与其他器官不同, 心脏再生能力有限, 并且在心肌梗死等病理生理条件下由于心肌细胞大量凋亡或坏死, 失去心肌原有的收缩功能, 影响正常的心脏泵血功能。不幸的是, 对于终末期心力衰竭患者来说, 心脏移植是主要的治疗选择, 然而供体器官供应有限。虽然药物治疗和手术能够改善心肌功能, 但仍缺乏有效的方法来补充缺失的组织, 这意味着心力衰竭仍然是导致世界范围内死亡的主要原因[42]。
hiPSCs具有分化成任何细胞类型(包括心肌细胞)的能力。在治疗脊髓损伤、视网膜黄斑变性、1-型糖尿病和心力衰竭方面的研究已经在进行中[43]。因此, hiPSC-CMs为心脏再生医学提供了巨大的潜力。目前已经提出用hiPSC-CMs进行心脏再生疗法来替代心脏移植[44]。再生医学有可能修复受损心肌, 目前已有实验研究表明将干细胞移植入心脏, 可以直接替换心肌梗死期间损伤的组织[45]。hiPSCs衍生的细胞能整合到宿主心肌中并产生有组织结构的肌节, 并且内皮细胞和平滑肌细胞有助于宿主血管生成。同时减少心肌梗死面积, 而不会诱发室性心律失常[46]。这些研究表明利用hiPSCs衍生的细胞用于心脏修复的可能性。
iPSC-CMs作为心肌修复的一种可能的自体细胞来源, 相对于其他细胞类型的细胞移植的主要优点是这些细胞是患者特异性的, 从而避免了与移植手术相关的组织排斥问题。iPSC-CMs在缺血微环境中释放促血管生成和抗凋亡因子并替换缺陷细胞、改善损伤或疾病状态下的功能恢复[47]。将鼠源iPSC-CMs植入小鼠心肌梗死模型中, 移植的iPSC-CMs在心肌内形成成熟的移植物, 表达心脏标志物并显示肌节结构。iPSC-CMs的心肌内移植显著改善了左冠状动脉结扎28 d后心肌重构和左心室功能[48]。可喜的是, 世界首例眼科疾病的细胞治疗试验已经启动[49], 通过注射器将iPSCs分化而来的视网膜细胞移植入患者眼睛里, 如果获得成功将有望实现再生医学的普及。
6 挑战iPSC-CM心肌细胞联合体外心脏毒性检测平台可大大减少后期化合物损耗。基于阻抗水平的心脏毒性评价平台具有准确识别结构和功能性心脏毒性的潜力。因此, 我们预计阻抗平台与hiPSC-CMs结合的实施将有助于开发更安全的药物并加快药物开发进程。
尽管临床前研究的结果令人鼓舞, iPSCs仍然还有许多障碍需要克服, 虽然iPSC-CMs显示了许多正常人心肌细胞的功能特征, 然而利用重编程技术分化的心肌细胞为"幼稚型"心肌细胞, 仍不完全成熟。并且缺乏成熟心肌细胞的相关特征, 如全功能的浆肌层网状结构和横管系统。利用实时定量PCR技术比较不同来源的心肌细胞之间的RNA水平时发现, hiPSC-CMs中肌节蛋白基因的表达水平更接近胎儿心肌细胞中的表达水平。具体而言, MYL2、MYH7、TNNI3、SCN5A和KCNH2的表达更接近胎儿水平, 而MYH6的表达类似于成人水平[50]。因此, 应用hiPSC-CMs于心脏毒性评价时仍应考虑未成熟hiPSC-CMs对毒物应答的影响。为了将iPSC-CMs转化为成熟的表型, 已经使用了多种技术, 如长期培养[51]、电刺激[52]等。此外, 就使用的重编程方法和iPSCs质量而言, 用相同方法得到的细胞系之间存在显著的种间差异, 细胞谱系特异性基因差异可能高达100倍[53], 同时各实验室重编程分化操作规程在参数(如培养基组成和培养方法)方面差异很大, 因而标准化操作规程需要进一步优化。众所周知, hiPSC-CMs是许多亚型心肌细胞的混合物(心室样、心房样和窦房结样), 同时心脏离子通道的表达也是多样的[36]。因此, 单个心肌细胞的膜片钳检测结果可能存在较大差异, 使得难以准确评估化合物致心律失常的风险。再者, 基于细胞阻抗的测定方法仅测量了心室、心房和淋巴结细胞混合群体, 当将阻抗数据与体内效应比较时, 需要考虑其他细胞类型在心血管效应中的作用。另外, 基于阻抗的测定忽略了药物代谢物或中枢/外周对心血管系统的作用[1]。
7 展望将hiPSCs应用于药物的研发、筛选、安全性评价, 可以大大降低药物研发成本, 减少种属差异, 增加药物毒性预测的准确性。同时, 由于hiPSCs可来源于患者自身, 可以增加药物研发的针对性, 实现个体化医疗, 而且是较为理想的疾病研究和药物研发模型。综上所述, 利用iPSCs细胞将为未来的药物研发提供一个有力的研发平台。
【致谢：感谢兰峰教授、王嘉显教授对本文提出的建议和意见。】
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