2018, Vol. 38 
核磁共振定量(qNMR)技术建立在核磁共振谱响应信号面积与样品中被激发的原子数目成正比的基础上, 在进行测定时不需要引入校正因子, 通过计算相应被激发原子数目达到定量的目的。由于这项技术无需使用对照品, 测定速度快以及消耗样品量少, 已经被包括《中华人民共和国药典》在内的各国药典收载[1-3], [4]52, 并广泛应用于药物质量控制领域[5-7]。
qNMR技术常用于原料药或制剂中药物含量测定, 也被应用于高分子聚合物中碳链长度等的测定[8]。作者之前利用qNMR技术, 测定了聚桂醇样品中脂肪碳链的长度及聚氧乙烯醚的聚合度, 并通过内标法进一步测定了聚桂醇的含量[9]。聚桂醇由多个环氧乙烷和月桂醇聚合而成, 分子式为C12H25(OCH2CH2)nOH, 用于食管曲张静脉出血等的硬化治疗[10]。聚桂醇在包括美国药典(USP)、欧洲药典及日本药局方在内的各主要药典中均有收录, 但是检查项及规定各异。由于聚桂醇中容易存在不同碳链长度的杂质或脂肪烃, NMR氢谱中杂质与聚桂醇的脂肪链响应信号重叠严重, 不同位置共振信号的化学位移较近, 难以分离, 所以1H NMR技术仅适用于对聚桂醇碳链长度及聚合度的快筛考察, 难以得到进一步的详细结构信息。
欧洲药典使用13C qNMR技术测定聚桂醇样品的碳链长度与聚合度[4]2594, 但是未探讨具体参数设置对结果的影响以及与1H qNMR技术得到的结果之间的区别。
本文利用13C qNMR技术测定聚桂醇成分中脂肪碳链长度与聚氧乙烯醚聚合度的详细信息, 将结果与1H qNMR的测定结果进行比较, 并进一步探讨了2种方法各自的优缺点, 探索了通过2种方法共用来加强对聚桂醇的质量控制。
1 仪器及样品及试剂 1.1 仪器Bruker Ascend 500型核磁共振仪(布鲁克公司), 5 mm PABBO探头及Topspin 3.2试验控制及数据处理软件；Mettler Toledo XP205电子天平(梅特勒-托利多公司)。
1.2 样品及试剂聚桂醇(陕西天宇制药有限公司), 氘代氯仿(> 99.9%, Sigma, 北京金欧翔科贸公司分装), 氘代甲醇(> 99.9%, Sigma, 北京金欧翔科贸公司分装), 乙酰丙酮铬(> 97%, Sigma)。
2 方法与结果 2.1 供试品溶液制备聚桂醇1H NMR定性定量试验:取聚桂醇样品适量, 用1 mL氘代氯仿溶解, 配制成浓度约为100 mmol·L-1的聚桂醇溶液, 转移0.6 mL溶液至核磁管中即得；13C qNMR试验:取100 mmol·L-1聚桂醇溶液0.4 mL, 置5 mm核磁管中, 加入含有0.1 mol·L-1乙酰丙酮铬的氘代氯仿与氘代甲醇混合溶液[氘代氯仿-氘代甲醇(1:1)]0.3 mL, 混匀即得。
2.2 实验条件及方法采用zg30脉冲序列在恒温(25 ℃)下获取1H-NMR谱；具体试验参数:谱宽(SWH)10 000 Hz, 采样点数(TD)64 K, 试验弛豫时间15 s, 采样次数(NS)16, 空扫次数(DS)2。采用zgig30脉冲序列在恒温(25 ℃)下获取13C-NMR谱, 以氘代氯仿为锁场溶剂；具体试验参数:谱宽(SWH)31 250 Hz, 采样点数(TD)64 K, 弛豫时间3 s, 采样次数(NS)12 288, 空扫次数(DS)4。
2.3 聚桂醇的1H-NMR、13C-NMR谱解析聚桂醇的氢谱在之前的报道中已有详细的分析与归属[9], 聚桂醇样品中脂肪碳链平均长度为12.4, 聚氧乙烯醚的聚合度n为9.4。碳谱由于响应范围更宽, 响应信号的分离更好；脂肪碳链上的碳出现在δ14~35之间, 聚氧乙烯醚中以及与羟基相连15位的碳由于氧的拉电子能力而出现在更低场部分。聚桂醇分子结构见图 1, 聚桂醇13C qNMR谱图、响应信号归属及积分见图 2、表 1。
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图 1 聚桂醇分子结构 Figure 1 Lauromacrogol structure |
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图 2 13C qNMR响应信号及归属 Figure 2 13C qNMR spectrum and assignments |
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表 1 聚桂醇13C-NMR峰归属及峰面积积分 Table 1 13C-NMR assignment and signal integration of lauromacrogol |
脂肪碳链长度可以由1~7位置碳响应面积相加得到:
Aδ14~33+Aδ71.60=0.985 1+1.000 0+1.006 0+7.499 7+ 1.025 6+1.017 2+1.079 8=13.6134, 修约为13.6。
谱图中δ 60~71以及δ 73.06处的峰代表与氧原子直接相连的碳, 由于每个聚氧乙烯中含有2个碳原子, 聚氧乙烯聚合度n=(Aδ 60~71+Aδ 73.06)÷2=(1.017 2+ 17.301 5+0.948 2)÷2=9.366 4, 修约为9.4。
3 讨论 3.1 仪器参数设定qNMR试验中一般要求信噪比S/N大于150以保证定量结果的准确性[11]。由于13C的自然丰度只有约1.1%, 13C NMR试验响应较低, 一般用于定性试验。但是为了准确测定碳链长度, 就需要使用13C qNMR技术。为了达到定量的目的, 要满足以下条件: 1)待测样品浓度足够大；由于13C响应低, 更需要使用尽量多的聚桂醇；2)扫描次数足够多, 使得响应信号的面积足够大来保证积分的准确性。普通的1H qNMR试验一般测定16~128次即可达到满意的结果, 但是13C qNMR试验需要更多扫描次数。欧洲药典要求扫描2 048次[4]2594, 本次试验中发现响应最低的δ 73.06信号的S/N达不到大于150的定量要求。实际测定中扫描次数超过12 000次才达到试验要求。
3.2 脉冲序列选择由于大量13C-1H偶合的发生, 会使13C NMR谱图裂分交叉, 难以准确积分, 因此采用适当的质子去偶技术便十分重要[12-13]。常用的去偶技术包括质子宽带去偶、偏共振去偶、选择性去偶、门控去偶及反门控去偶等。为了严格保证13C NMR谱图中各碳的响应信号强度与对应的碳原子个数成比例, 只有使用反门控去偶技术。质子去偶器只在自由感应衰减(FID)采集期间打开, 从而得到无奥弗豪塞尔核效应(nuclear overhauser effect, NOE)增益的去偶谱图, 保证响应信号与碳原子个数之间的对应关系, 满足定量的要求。由于这项技术会降低信号灵敏度, 必须通过增加样品浓度以及采样次数来弥补。这也是13C qNMR试验比较耗时的原因之一。
3.3 弛豫时间的设定以及弛豫试剂的添加弛豫延迟时间是指NMR试验中一次采样结束后到下一次脉冲开始之间的时间[14]。qNMR试验中一般需要设定比较长的弛豫延迟时间来保证脉冲测定时上一次激发原子核回到初始态, 保证积分的准确性。但是这个时间的设定也延长了整个实验的耗时。由于碳核的驰豫时间相对较长, 所以13C qNMR试验中如果设定足够长的弛豫延迟时间, 由于扫描次数很多, 可能会耗时几天或者更久, 操作不便, 需要加入弛豫试剂。弛豫试剂是一类顺磁性物质, 本身不产生NMR响应, 可以吸收激发态13C原子转移的能量, 从而加快被激发原子核回归到基态, 有效降低弛豫延迟时间。本实验中加入0.1 mol·L-1的乙酰丙酮铬, 可以有效降低弛豫延迟时间。试验中设定弛豫时间为3 s, 结果良好。
3.4 碳链长度及聚氧乙烯醚聚合度计算氢谱计算脂肪碳链长度过程中, 需要首先归属氢的响应信号属于甲基或者亚甲基, 利用氢的响应信号面积除以相应的氢原子数间接得到碳原子数, 再将属于脂肪碳链的碳原子个数相加得到脂肪碳链长度。而13C qNMR的原理及计算就更为简便, 只需要将组成脂肪碳链的C1~C7对应的响应积分面积相加即可得到脂肪碳链长度, 本次试验测定结果为13.6, 与利用1H qNMR测定出的12.4结果相近。
由于聚氧乙烯醚结构中含有2个碳原子, 其聚合度n的值为碳原子个数除以2, 相应计算方法为C8~14对应的响应信号积分面积之和除以2。本文中测得的聚氧乙烯醚的聚合度n为9.4, 与之前报道的使用1H qNMR技术测得的聚合度值n[9]相同, 表明2种方法均具有可行性。
3.5 1H qNMR和13C qNMR方法比较1H qNMR使用样品量少(~20 mg), 测定速度快(约15~20 min), 但是易受杂质等干扰, 尤其是在测定含有不同脂肪碳链长度的杂质以及脂肪烃时, 由于响应信号重叠严重, 结果容易发生偏差；13C qNMR技术虽然耗时久(约20 h), 但是由于碳谱本身的范围广, 响应信号之间分离更好, 可以有效排除杂质的干扰, 测定结果更为可靠。
4 结论1H qNMR和13C qNMR 2种技术各有特点, 1H qNMR技术适合于快检及初筛考察聚桂醇类化合物结构及质量, 13C qNMR技术合适在氢谱的基础上, 详细深入地获取聚桂醇样品的结构信息, 排除杂质干扰, 加强对其的质量控制。通过2种方法结合使用, 根据不同的检测需求选择合适的技术, 为聚桂醇类产品的全面质量控制奠定基础。
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