2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
2. 河南省食品药品检验所, 郑州 450008;
3. 河南省口岸食品检验检测所, 郑州 450003;
4. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. Henan Provincial Institute of Food and Drug Control, Zhengzhou 450008, China;
3. Food Inspection and Testing Institute of Henan Province, Zhengzhou 450003, China;
4. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
左归丸是由我国明代的温补派代表名医张景岳从六味地黄丸化裁而成, 该处方载于其所著《景岳全书·新方八阵》。全方由熟地黄、菟丝子、牛膝、山药、山茱萸、枸杞子6味植物药加上龟甲胶、鹿角胶2味动物药组成, 具有滋肾补阴及填精益髓之功效, 用于真阴不足, 腰酸膝软, 盗汗遗精, 神疲口燥, 真阴不足, 肾精亏虚之证的治疗[1-4]。临床研究表明, 左归丸在心脑血管疾病、骨科疾病、生殖系统疾病等多类疾病的治疗中有着广泛的应用。同时, 试验研究也证实了左归丸具有修复神经损伤, 改善骨组织代谢, 促进生殖发育, 调节内分泌, 调节免疫系统等作用[4-9]。
左归丸共有8个批准文号, 制法为将六味植物药粉碎成细粉, 过筛混匀。取鹿角胶、龟板胶烊化, 与上述细粉混匀, 然后加炼蜜制丸[1]。现行标准收载于卫生部颁布的药品标准《中药成方制剂》第1册[1], 该标准除规定了【处方】和【制法】外, 在检测项目中仅有【性状】及【水分】、【重量差异】、【装量差异】、【溶散时限】等丸剂项下的有关规定的检查项。很显然, 该标准的检测项目及标准方法设置过少, 缺乏有效的定性和定量的质控项目及方法, 具体表现为在检测项目方面缺少常规的鉴别项(包括显微鉴别和薄层鉴别)及含量测定项, 在检测方法方面缺少强专属性和准确度的色谱检测方法, 因此该标准无法准确而有效地评价和控制左归丸的药品质量。此外, 该标准已数十年未曾修订, 而一些研究[10]多从含量测定角度出发, 较少考虑到药品标准常规的显微鉴别和薄层鉴别。鉴于此, 本文从山药、熟地黄、枸杞子、菟丝子以及山茱萸等重要药材原料组方的鉴别(显微鉴别和薄层鉴别)和含量测定等方面, 对左归丸开展了较为系统的标准研究工作, 以期能够为该品种的质量标准修订提供参考, 更好地推动该品种的质量评价与监管工作。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪及VWD检测器(Agilent公司)；SIGMA3-30ks高速台式冷冻离心机(Sigma-Aldrich公司)；Digistore薄层色谱数码成像系统(CAMAG公司)；XPE205电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；GZX-DH-400-BSII电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司), IKA C-MAG HP 7加热器(IKA公司), XMTD-204数显式电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)。
1.2 试药对照药材熟地黄(批号121196-200804)、枸杞子(批号1066-200203)、菟丝子(批号1066-200203)及对照品马钱苷(批号111640-201005, 含量99.2%)、莫诺苷(批号111998-201602, 含量96.3%)均来自中国食品药品检定研究院。左归丸样品由3家生产企业提供, 按顺序编号, 1~11号为A厂家(批号141102、141103、141107、151202、160106、160112、160202、161001、161002、161003、161005), 12~14号为B厂家(批号140743、150302、160907), 15~17号为C厂家(批号16030058、17030012、17030014)。原料药材熟地黄、炼蜜、山茱萸、菟丝子、牛膝、龟甲胶、山药、枸杞子、鹿角胶及缺熟地黄、枸杞子、菟丝子、牛膝的左归丸阴性制剂均由仲景宛西制药股份有限公司提供。甲醇、乙腈为色谱纯(Merck公司), 水为超纯水, 其他试剂为分析纯(洛阳昊华化学试剂有限公司)。
2 方法与结果 2.1 显微特征鉴别左归丸样品研细, 置显微镜下观察(见图 1):淀粉粒三角状卵形或矩圆形, 脐点短缝状或人字状, 草酸钙针晶束偶见, 存在于黏液细胞中或破碎散在(山药)。薄壁组织灰棕色至黑棕色, 细胞多皱缩, 内含棕色核状物(熟地黄)。种皮石细胞表面观不规则多角形, 壁厚, 波状弯曲, 层纹清晰(枸杞子)。种皮栅状细胞2列, 内列较外列长, 有光辉带(菟丝子)。
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1.淀粉粒(starch grains) 2.草酸钙针晶束(calcium oxalate crystal beam) 3.薄壁细胞(parenchyma cells) 4.种皮石细胞(stone cells of seed coat) 5.种皮栅状细胞(palisade cells of seed coat) 图 1 左归丸显微鉴别特征图 Figure 1 Microscopic characteristics of Zuogui pills |
取样品2 g, 研细, 加水60 mL, 置电热板上加热煮沸30 min, 放冷, 离心(3 000 r·min-1)10 min, 取上清液, 用乙酸乙酯振摇提取2次, 每次30 mL, 合并乙酸乙酯液, 蒸干, 残渣加甲醇1 mL溶解, 即得供试品溶液。按处方中比例制备缺熟地黄的阴性样品, 按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。取熟地黄对照药材1 g, 加水40 mL, 置电热板上煎煮30 min, 放冷, 离心(3 000 r·min-1)10 min, 取上清液, 用乙酸乙酯振摇提取2次, 每次20 mL, 合并乙酸乙酯液, 蒸干, 残渣加甲醇1 mL使溶解, 即得对照药材溶液。
2.2.1.2 色谱条件采用硅胶G薄层预制板(200 mm×100 mm, 青岛海洋化工有限公司), 以二甲苯-乙酸乙酯(1:1)为展开剂, 2, 4-二硝基苯肼乙醇试液为显色剂；供试品溶液及阴性对照溶液点样量均为5 μL, 熟地黄对照药材溶液点样量为4 μL。
2.2.1.3 鉴别结果供试品溶液、阴性对照溶液及熟地黄对照药材溶液在上述色谱条件下进行薄层色谱鉴别, 结果见图 2。在图 2中, 与对照药材色谱相应的位置上, 样品色谱均显相同颜色的斑点, 而阴性样品色谱则无对应的斑点。
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1.熟地黄对照药材(reference crude drug of Rehmanniae Radix Praeparata)2.阴性样品(negative sample without Rehmanniae Radix Praeparata) 3. 5号样品(No. 5 sample) 4. 6号样品(No. 6 sample) 5. 12号样品(No. 12 sample) 6. 13号样品(No. 13 sample) 7. 16号样品(No. 16 sample) 8. 17号样品(No. 17 sample) 图 2 左归丸中熟地黄薄层鉴别色谱图 Figure 2 TLC chromatograms of Zuogui pills for the identification of Rehmanniae Radix Praeparata |
取样品2 g, 研细, 加水40 mL, 加热煮沸15 min, 放冷, 滤过, 滤液加15 mL乙酸乙酯萃取, 分取乙酸乙酯液, 浓缩至1 mL, 即得供试品溶液。按处方中比例制备缺枸杞子的阴性样品, 按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。取枸杞子对照药材0.5 g, 按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。
2.2.2.2 色谱条件采用硅胶G薄层预制板, 以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2:3:1)为展开剂, 于紫外灯366 nm下检视, 点样量均为5 μL。
2.2.2.3 鉴别结果取供试品溶液、阴性对照溶液及枸杞子对照药材溶液在上述色谱条件下进行薄层色谱鉴别, 结果见图 3。在图 3中, 与对照药材色谱相应的位置上, 样品色谱均显相同颜色的荧光斑点, 而阴性样品色谱则无对应的荧光斑点。
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1.枸杞子对照药材(reference crude drug of Lycii Fructus) 2.阴性样品(negative sample of Lycii Fructus) 3. 5号样品(No. 5 sample) 4. 6号样品(No. 6 sample) 5. 12号样品(No. 12 sample) 6. 13号样品(No. 13 sample) 7. 16号样品(No.16 sample) 8. 17号样品(No. 17 sample) 图 3 左归丸中枸杞子薄层鉴别色谱图 Figure 3 TLC chromatogram of Zuogui pills for the identification of Lycii Fructus |
取莫诺苷和马钱苷的对照品适量, 加50%甲醇水溶液分别制成每1 mL均含80 μg的溶液, 即得。
2.3.1.2 供试品溶液取装量差异项下的样品, 研细, 取粉末约0.7 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入50%甲醇水溶液25 mL, 称量, 加热回流1 h, 放冷, 补足减失的量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。
2.3.1.3 阴性对照溶液按照处方比例制备缺山茱萸的阴性样品, 按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。
2.3.2 色谱条件采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm, 5 μm), 柱温35 ℃, 流动相为乙腈(A)-0.3%磷酸水溶液(B), 梯度洗脱(0~5 min, 5%A→8%A；5~20 min, 8%A；20~35 min, 8%A→20%A), 流速1.0 mL·min-1, 检测波长240 nm, 进样量10 μL。
在上述色谱条件下, 对照品、样品色谱图见图 4-A、B、C、D。
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1.莫诺苷(morroniside) 2.马钱苷(loganin) 图 4 莫诺苷对照品(A)、马钱苷对照品(B)、6号样品(C)及阴性样品(D)高效液相色谱图 Figure 4 HPLC chromatograms of morroniside reference substance(A), loganin reference substance(B), sample No. 6(C) and negative sample without Corni Fructus(D) |
精密吸取6号样品的供试品溶液10 μL, 连续进样6次, 测得莫诺苷和马钱苷峰面积的RSD均为0.1%, 表明仪器进样精密度良好。
2.3.4 线性关系考察精密吸取莫诺苷对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL, 分别置于10 mL量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 即得系列对照品溶液；精密吸取上述对照品溶液各10 μL, 分别注入液相色谱仪, 以色谱峰面积积分值对进样量进行线性回归, 得到莫诺苷线性回归方程:
Y=245.17X-150.19 r=0.999 9
同法得到马钱苷线性回归方程:
Y=218.07X-135.86 r=0.999 8
结果表明, 莫诺苷和马钱苷进样量分别在0.08~ 0.80 μg和0.08~0.85 μg范围内线性关系良好。
2.3.5 重复性试验取6号样品6份, 按照“2.3.1.2”项下方法制备供试品溶液, 进样测定；测得莫诺苷和马钱苷的平均含量分别为0.632 mg·g-1和0.604 mg·g-1, RSD分别为2.1%和1.7%。
2.3.6 加样回收试验取已测知含量(马钱苷0.604 mg·g-1, 莫诺苷0.632 mg·g-1)的6号样品粉末6份, 每份约0.35 g, 精密称定, 置锥形瓶中, 精密加入含莫诺苷对照品(51.193 2 μg·mL-1)及含马钱苷对照品(45.592 2 μg·mL-1)的50%甲醇水溶液各5 mL, 精密加入50%甲醇水溶液15 mL, 按“2.3.1.2”项下方法, 自“称量, 加热回流1 h”起操作, 制备供试溶液, 进样测定, 结果见表 1。
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表 1 加样回收率测定结果 Table 1 Recovery test results |
取缺山茱萸的阴性对照溶液, 注入液相色谱仪, 记录色谱图(图 4-D)。图 4-D中, 在与对照品色谱峰相应的位置上, 无干扰色谱峰出现, 说明专属性好。
2.3.8 稳定性试验取6号样品的供试品溶液, 分别在0、1、2、4、8、12、16、24 h进样测定, 莫诺苷和马钱苷色谱峰面积的RSD分别为0.11%、0.27%。结果表明, 供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.3.9 样品测定取17批左归丸样品, 按“2.3.1.2”项下方法制备供试品溶液, 按外标法计算样品中莫诺苷、马钱苷的含量, 结果见表 2。
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表 2 样品测定结果(n=2) Table 2 The determination results |
在本研究中, 发现3个厂家生产的左归丸的外观性状存在相对较大的差异, 尤其B厂家生产的左归丸的外表面呈深褐色, 且分布有明显的黄白色的植物药颗粒状(图 5)。原标准[1]中对左归丸制法规定使用6种植物药的“细粉”投料, 性状规定为“黑色水蜜丸”, 《中华人民共和国药典》[11]对细粉的规定为“能全部通过5号筛, 并含能通过6号筛不少于95%的粉末”, 显然B厂家产品的生产工艺及性状值得进一步深入探讨。
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图 5 左归丸性状对比 Figure 5 Comparison of characters of Zuogui pills |
本文对左归丸组方各药材的显微鉴别特征进行了研究, 发现山茱萸和牛膝在左归丸成药中的显微特征不明显；建议在左归丸质量标准中增加山药、熟地黄、枸杞子和菟丝子的显微特征的鉴别。
3.3 龟板胶和鹿角胶的定性鉴别在研究过程中, 考虑到左归丸组方中龟板胶和鹿角胶2味动物药缺乏相关检测项目, 曾参考《中华人民共和国药典》“龟甲胶”[12]181品种项下的理化鉴别(1)进行试验, 结果由于供试品溶液、阴性对照溶液和空白溶液的颜色较深, 加入反应试剂后颜色变化不明显, 效果不佳。计划下一步参考相关文献[13-15], 对该品种龟板胶和鹿角胶的特征肽段特征鉴别检测方法进行研究。
3.4 菟丝子和牛膝的薄层色谱鉴别在薄层色谱鉴别方法研究时, 曾进行了左归丸中菟丝子和牛膝的薄层色谱鉴别, 但效果均不佳, 有待进一步优化样品提取方法以及相应的薄层色谱方法。
3.5 含量测定的限度制定17批样品中的莫诺苷与马钱苷含量范围分别为0.230 9~0.632 1 mg·g-1和0.345 1~0.603 5 mg·g-1, 两者含量总和为0.635 8~1.235 6 mg·g-1, 且各批次之间差异较大。17批样品中仅有5批样品的马钱苷含量低于莫诺苷, 其余12批样品的马钱苷含量均高于莫诺苷。此外, 由左归丸标准[1]的处方及制法可知每100 g左归丸中应含10.39 g的山茱萸药材, 再根据《中华人民共和国药典》[12]27“山茱萸”项下规定可换算出左归丸中莫诺苷与马钱苷含量总和为不得低于1.246 8 mg·g-1, 而这17批样品均未达到这一标准, 推测在实际生产过程中, 可能会有这2个成分的流失, 具体原因有待进一步研究。
4 总结左归丸由8味药材制成, 然而原标准中检验项目极为简单, 项目设置非常不完善, 无法真实客观评价左归丸产品的质量状况, 更加无法有效地控制产品质量。本研究从质量标准的角度对左归丸的显微特征、薄层色谱鉴别以及含量测定方法进行了较为系统的研究, 以期为该品种质量标准的提高和修订提供一些参考。
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