软肝缩脾丸为医院自主开发的中药复方制剂[批准文号:总制字(2016)F403005], 由赤芍、丹参、大黄、五味子、黄芪、莪术、紫河车、鳖甲(炮)、水蛭(制)、桃仁(炒)、土鳖虫(制)、三七12味药材加工制成, 具有益气活血破瘀及软坚散结消痞之功效, 适用于各种病因引起的慢性肝炎、肝硬化或无症状病毒携带者^[1-3]。赤芍清热凉血, 散瘀止痛, 其指标成分芍药苷具有免疫调节, 抗炎, 保肝, 防止肝纤维化等作用^[4]；丹参活血祛瘀, 通经止痛, 清心除烦, 凉血消痈, 其指标成分是丹参酮类和丹酚酸B, 具有抗肝损伤, 抗肝纤维化等保肝护肝作用^[5-6]；大黄泻下攻积, 清热泻火, 凉血解毒, 逐瘀通经, 利湿退黄, 其指标成分大黄酸、大黄素、大黄酚等, 有保肝利胆, 降低肝脏纤维化之功效^[7]；五味子收敛固涩, 益气生津, 补肾宁心, 其指标成分五味子醇甲具有抗肝纤维化, 降酶保肝的作用^[8]。

本课题组前期研究建立了HPLC法同时测定软肝缩脾丸中芍药苷和丹酚酸B含量^[9], 并将其作为软肝缩脾丸质量标准的含量测定项^[3]。但是中药复方制剂的药味较多, 化学成分复杂, 各有效成分的含量及其比例均会影响其药效, 故单一或者少数几个指标成分不能全面反映其内在质量^[10-11]。从多种有效成分同时监控的角度出发, 根据《中华人民共和国药典》对于单味中药的质量标准^[12], 本研究建立了HPLC法同时测定赤芍(芍药苷)、丹参(丹参酮Ⅱ_A、丹酚酸B)、大黄(大黄酸、大黄素、大黄酚)、五味子(五味子醇甲)4味中药7个有效成分的方法, 能更全面反映软肝缩脾丸的内在质量。

1 仪器与试药

岛津公司SHIMADZU 10A高效液相色谱仪(配置SPD-10A紫外检测器、二元泵)；岛津公司Wondasil C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm；填料:十八烷基硅烷键合硅胶)；Sartorius公司BT125D型1/10万分之一电子分析天平；天津Auto-science公司AS3120A型超声波清洗器。

对照品芍药苷(批号110736-201136, 含量96.0%)、丹酚酸B(批号111562-201313, 含量97.0%)、大黄酸(批号110757-201607, 含量99.3%)、五味子醇甲(批号110857-201513, 含量99.9%)、大黄素(批号110756-201512, 含量98.7%)、大黄酚(批号110796-201319, 含量99.6%)、丹参酮Ⅱ_A(批号110766-201520, 含量98.9%)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈(天津市四友精细化学品有限公司)为色谱纯, 甲醇(天津市富宇精细化工有限公司)和磷酸(青岛宝泽化工有限公司)为分析纯, 水为自制重蒸水。软肝缩脾丸, 批号160831、161124、161216, 由解放军第一五三中心医院制剂室生产。

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品溶液

分别精密称取各对照品适量, 加甲醇制成含芍药苷501.89 μg·mL^-1, 丹酚酸B 512.55 μg·mL^-1, 大黄酸42.14 μg·mL^-1, 五味子醇甲45.71 μg·mL^-1, 大黄素33.44 μg·mL^-1, 大黄酚72.59 μg·mL^-1, 丹参酮Ⅱ_A 18.80 μg·mL^-1的混合对照品储备液。精密量取储备液2 mL, 置10 mL量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 即得混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

取样品适量, 除去包衣, 研细, 取1 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入80%甲醇水溶液25 mL, 称定质量, 超声处理(功率120 W, 频率40 kHz)30 min, 放冷, 再次称定质量, 用80%甲醇水溶液补足缺失的质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 以0.45 μm微孔滤膜滤过, 即得。

2.1.3 阴性样品溶液

按处方分别制备不含赤芍、不含丹参、不含大黄、不含五味子的阴性样品, 再按“2.1.2”项下方法制备各阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

采用Wondasil C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B), 梯度洗脱(0~15.0 min, 82%B→70%B；15.0~30.0 min, 70%B→45%B；30.0~35.0 min, 45%B；35.0~60.0 min, 45%B→28%B)；检测波长: 230 nm(0~34.0 min, 检测芍药苷、丹酚酸B、大黄酸)、217 nm(34.0~37.0 min, 检测五味子醇甲)、225 nm(37.0~56.0 min, 检测大黄素、大黄酚)、270 nm(56.0~60.0 min, 检测丹参酮Ⅱ_A), 流速1.0 mL·min^-1, 柱温30 ℃, 进样量10 μL。

2.3 方法学考察 2.3.1 系统适用性试验

分别取混合对照品溶液、供试品溶液及各阴性样品溶液, 按“2.2”项下色谱条件进样测定, 记录色谱图(图 1)。结果显示, 混合对照品溶液与供试品溶液中各指标成分色谱峰的理论塔板数均大于5 000, 分离度均大于1.5。各阴性样品溶液的色谱图显示其他成分对各指标成分的测定均无干扰。

2.3.2 线性关系考察

精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL, 分别置于10 mL量瓶中, 加甲醇定容, 摇匀, 即得系列浓度的混合对照品溶液。按“2.2”项下色谱条件进样测定, 记录峰面积, 以峰面积积分值(Y)为纵坐标, 质量浓度(X)为横坐标, 进行线性回归, 得各成分的回归方程、相关系数(r)和线性范围, 见表 1。

2.3.3 精密度试验

精密吸取“2.1.1”项混合对照品溶液10 μL, 按“2.2”项下色谱条件连续进样6次, 记录峰面积。结果芍药苷、丹酚酸B、大黄酸、五味子醇甲、大黄素、大黄酚、丹参酮Ⅱ_A峰面积的RSD分别为1.1%、1.2%、0.79%、1.4%、1.6%、0.98%、1.2%, 表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验

取同一批样品(批号161216)除去包衣后研细的粉末6份, 按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液, 按“2.2”项下色谱条件测定。结果芍药苷、丹酚酸B、大黄酸、五味子醇甲、大黄素、大黄酚、丹参酮Ⅱ_A的平均含量分别为2.765、3.072、0.202、0.219、0.151、0.326、0.086 mg·g^-1, RSD分别为1.4%、0.69%、0.39%、1.1%、1.4%、0.87%、1.7%, 表明方法的重复性良好。

2.3.5 稳定性试验

取同一供试品溶液, 室温放置, 按“2.2”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果芍药苷、丹酚酸B、大黄酸、五味子醇甲、大黄素、大黄酚、丹参酮Ⅱ_A峰面积的RSD分别为1.2%、0.75%、1.4%、1.2%、1.4%、0.83%、0.95%, 表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验

取同一批已知含量的样品(批号161216)9份, 每份约0.5 g, 精密称定, 平均分成3组, 分别按已知含量的50%、100%、150% 3个水平加入混合对照品溶液, 按“2.1.2”项下方法平行制备供试溶液, 依法测定, 计算各成分的回收率, 结果见表 2。

2.4 样品测定

取3批样品各3份, 分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液, 按“2.2”项下色谱条件进样测定, 以外标法计算样品中7个成分的含量, 结果见表 3。

3 讨论 3.1 流动相的考察

本实验采用梯度洗脱的方式来保证各个成分的有效分离, 同时考察筛选了不同的流动相系统^[13-16], 包括甲醇-磷酸水溶液、甲醇-乙腈-磷酸水溶液、甲醇-乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液, 最终选择乙腈-磷酸水溶液体系；同时考察了磷酸溶液浓度(0.05%、0.1%、0.2%)对分离的影响, 确定了0.1%磷酸水溶液。

3.2 检测波长的选择

考虑到所测成分较多, 扫描了各成分在200~400 nm波长范围的紫外吸收图谱, 发现芍药苷、丹酚酸B、大黄酸在230 nm波长处均有较大的吸收；大黄素和大黄酚在225 nm波长附近有最大吸收；五味子醇甲和丹参酮Ⅱ_A的最大吸收波长分别为217 nm、270 nm。故本实验采用分段变波长法检测上述7个成分, 提高了测定的灵敏度和准确性。

3.3 样品提取方法的考察

本实验分别考察了提取溶剂(50%甲醇、50%乙醇、80%甲醇、75%乙醇水溶液)、提取方式(超声、回流)、提取溶剂用量(15、25、40 mL)、提取时间(20、30、45 min)对测定结果的影响。最终确定为取样品1 g, 加入80%甲醇水溶液25 mL, 超声(功率120 W, 频率40 kHz)处理30 min。

3.4 其他

样品的测定结果显示, 芍药苷、丹酚酸B、大黄酸、五味子醇甲、大黄素、大黄酚、丹参酮Ⅱ_A的含量均较高, 特别是芍药苷、丹酚酸B、五味子醇甲、大黄酚的量特别高, 但大黄酸、五味子醇甲、大黄素含量有一定的差异, 可能与不同的原药材供货商和不同的药材产地有关。下一步研究开展软肝缩脾丸的长期试验, 考察7个成分在制剂中的稳定性, 同时, 也要对原药材的产地和质量进行严格控制。

3.5 小结

本实验建立了采用高效液相色谱法同时测定软肝缩脾丸中上述7个指标成分的方法。该方法前处理简单, 所测成分分离度好, 测定结果稳定可靠, 重复性好, 能更全面地反映软肝缩脾丸的内在质量。