2018, Vol. 38 
2. 江西省药品检验检测研究院, 江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心, 南昌 330029;
3. 解放军第九四医院, 南昌 330002
2. Jiangxi Institute for Drug Control, Jiangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality, Nanchang 330029, China;
3. The 94 th Hospital of PLA, Nanchang 330002, China
连钱草为唇形科植物活血丹Glechoma longituba（Nakai）Kupr.的地上部分；春至秋季采收，除去杂质，晒干；质量标准收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部，味辛、微苦，性微寒，归肝、肾、膀胱经；具有清热解毒，利尿排石，散瘀消肿的功效[1]，临床用于热淋、石淋、湿热黄疸、疮痈肿痛、跌打损伤[2-4]。因质量标准中无含量测定项，本课题组从连钱草中分离得到化合物咖啡酰羟基乙酸和丹酚酸A。丹酚酸A是一种水溶性酚酸类化合物，最早是由黎莲娘于丹参中分离得到[5]，其具有显著的抗氧化、心肌缺血保护、抗血栓、神经保护、抗肝纤维化和防治糖尿病及并发症等药理活性[6-8]；咖啡酰羟基乙酸为一种天然的水溶性酚类化合物，具有抗炎活性[9-10]；咖啡酸具有收缩增固微血管，促进凝血因子功能，升高白血球及血小板之功效，用于白细胞、血小板减少症的治疗[11-13]；迷迭香酸有着广泛的生物学活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、抗血栓和抗血小板凝聚以及对细胞的保护作用[14-15]。目前尚未有文献报道采用HPLC法同时测定连钱草中上述4个成分的含量。因此，本实验建立了采用反相高效液相色谱法同时测定连钱草中咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A 4个酚酸类化合物含量的测定方法，考察了8批连钱草药材中4个成分的含量差异，为进一步完善连钱草药材的质量评价方法提供参考依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器安捷伦公司Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括G1311C四元泵、在线脱气机、G1315D DAD、G1329B自动进样器、LC1260色谱工作站、G1316A柱温箱；赛多利斯公司Sartorius BT25S电子天平（十万分之一），Sartorius BSA124S-CW电子天平（万分之一）。
1.2 试药对照品咖啡酰羟基乙酸和丹酚酸A为本课题组自制，通过1H-NMR、13C-NMR、MS等手段确证了其结构，HPLC法检测纯度 > 98%（面积归一法）；对照品咖啡酸（批号110885-200102）和迷迭香酸（批号111871-201414）购自中国食品药品检定研究院，纯度均 > 98%。水为娃哈哈饮用纯净水，乙腈（Sigma公司）为色谱纯，甲醇及乙醇（上海振兴化工一厂）、甲酸（西陇科学股份有限公司）为分析纯。8批连钱草药材样品均由江西济生制药厂提供。
2 溶液的制备 2.1 混合对照品溶液精密称取咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A的对照品适量，加甲醇制得质量浓度分别为0.034、0.014、0.524 5和0.008 4 mg·mL-1的混合溶液，即得。
2.2 供试品溶液取连钱草粉末（过2号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇水溶液50 mL，密塞，称量，加热回流1 h，放冷，称量，用70%乙醇水溶液补足减失的量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加30 mL水使溶解，置于分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次40 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。
3 色谱条件采用资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~14 min，19%A；14~25 min，19%A→34%A；25~35 min，34%A），流速1.0 mL·min-1，检测波长330 nm，进样量10 μL；在上述色谱条件下，样品色谱中与各对照品峰对应的吸收峰的理论板数均不低于3 000，色谱图见图 1。
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1.咖啡酸（caffeic acid）2.咖啡酰羟基乙酸（caffeoylglycolic acid）3.迷迭香酸（rosmarinic acid）4.丹酚酸A（salvianolic acid A） 图 1 混合对照品（A）、S3号连钱草药材（B）HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and Glechomae Herba sample No.S3(B) |
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、25，分别按“3”项下色谱条件进样分析，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得4个成分的回归方程，结果见表 1。
4.2 精密度试验精密吸取混合对照品溶液10 μL，按“3”项下色谱条件连续进样6次，依次测定峰面积，结果咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A峰面积的RSD（n=6）分别为0.29%、0.60%、0.19%、1.1%，表明仪器精密度良好。
4.3 稳定性试验精密吸取供试品溶液10 μL，按“3”项下色谱条件，在24 h内于0、1、2、4、8、12、24 h分别进样测定，结果咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A峰面积的RSD（n=7）分别为0.38%、1.0%、0.60%、1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
4.4 重复性试验取同一批连钱草药材粉末（过2号筛）6份，各约1 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“3”项下色谱条件进样测定，测得咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A平均含量（n=6）分别为0.326、0.145、4.553、0.084 mg·g-1，RSD分别为0.53%、0.81%、0.48%、1.1%。
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表 1 4个成分的线性关系 Table 1 Linearity of 4 components |
精密称取“4.4”项下已测知含量的连钱草药材粉末（过2号筛）9份，每份约0.5 g，3份为一组，精密称定; 分别精密加入对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制成低、中、高3个浓度的供试溶液，并按“3”项下色谱条件进样测定，计算平均回收率，结果见表 2。
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表 2 回收率试验结果 Table 2 Results of recovery |
同一批连钱草药材粉末（过2号筛）约1 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别采用资生堂CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、岛津Inertsil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）、费罗门Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3种品牌的色谱柱，按“3”项下色谱条件进行测定，结果无明显差别。
5 样品含量测定分别取不同产地的连钱草药材粉末（过2号筛），每批取2份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“3”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，用外标法计算出咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A的含量，结果见表 3。
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表 3 样品含量测定结果（n=2） Table 3 Results of content determination of samples |
应用DAD检测器在190~400 nm范围内对咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A进行光谱扫描；结果表明，在330 nm波长附近4个成分吸收系数均最大，干扰少且稳定，故选择330 nm作为检测波长。
6.2 供试品溶液制备方法的考察考察了回流提取法和超声提取法对咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A含量测定的影响；结果显示，回流提取法提取更完全，故选择回流提取法。提取溶剂考察了水、甲醇溶液（30%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、甲醇）、乙醇溶液（30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液、乙醇）；结果显示，采用70%乙醇水溶液提取时咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A含量均较高。提取时间考察了0.5、1、1.5 h；结果显示1 h可提取完全。提取体积考察了50、100 mL；结果显示无明显差别，故将提取体积定为50 mL。
6.3 流动相的确定考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液4个溶剂系统；结果显示，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，所得色谱峰峰形较好，分离效果最佳。
6.4 小结本实验对8批不同产地连钱草药材中咖啡酸、咖啡酰羟基乙酸、迷迭香酸和丹酚酸A成分的含量进行测定；结果显示，各个产地含量差异较大，河南信阳的含量最高，相同产地的含量同样存在差异，由于收集的批次较少，对于哪个产地适合连钱草的种植，需要收集更多的产地及批次进一步研究，为种植连钱草药材选择出合适的种植产地。本实验所建立的定量方法色谱峰分离效果较好，基线较平，重现性较好。对进一步完善连钱草药材的质量评价方法提供参考依据。
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