2018, Vol. 38 
2. 首都医科大学中医药学院, 北京 100069;
3. 广东东阳光药业有限公司, 东莞 523808
2. School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China;
3. Sunshine Lake Pharma Co., Ltd., Dongguan 523808, China
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，主要分布在我国青海、西藏、甘肃、云南和四川等高海拔地区，是传统的名贵中药材，在中国有悠久的药用历史，具有补肾益肺、止血化痰的功效[1-3]。近年来，冬虫夏草的人工繁育技术获得突破，为冬虫夏草野生资源稀缺可持续发展提供了一条途径[4]。核苷类成分是冬虫夏草的主要活性成分，具有明显的药理活性，《中华人民共和国药典》（以下简称中国药典）以腺苷为含量测定指标。冬虫夏草的核苷类成分研究较多，尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、2′-脱氧腺苷等为含量较高的5个核苷[5-10]。
一测多评法作为一种对多指标质量控制的有效方法，只测定某个代表性成分，同时可计算出其他待测成分的含量，是一种适合中药特点的多指标质量评价的新模式[11-15]。冬虫夏草作为一种常用中药材，仅有1篇文献报道采用一测多评法测定尿苷、尿苷和腺苷3个成分[16]。本实验以腺苷对照品作为内标物，建立其与尿苷、肌苷、鸟苷、2′-脱氧腺苷的相对校正因子进行含量计算，并考察方法耐用性及系统适用性，以验证一测多评法在冬虫夏草多指标质量控制中应用的适用性及可行性。
1 仪器与试药Ultimate 3000型液相色谱仪（Thermo公司），QUINTIX313-1CN型万分之一电子天平（Sartorius公司），MSE125S型十万分之一电子天平（Sartorius公司），KQ-500DV型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司），Milli-Q去离子水发生器（密理博公司）。
对照品尿苷（批号110887-200202）、肌苷（批号140669-201305）、鸟苷（批号111977-201501）和腺苷（批号110879-200202）均由中国食品药品检定研究院提供，2′-脱氧腺苷由上海源叶生物技术公司提供，HPLC-DAD（面积归一化法）检测纯度均大于98.0%。甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher公司），试验用水为超纯水。
10批野生冬虫夏草（YS-1~YS-10号样品）采自于西藏自治区、青海省、四川省、甘肃省、云南省；10批冬虫夏草人工繁育品（RG-1~RG-10号样品）由广东东阳光药业有限公司提供，均经中国食品药品检定研究院郑健研究员鉴定为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品溶液取尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和2′-脱氧腺苷的的对照品适量，精密称定，加20%甲醇制成每1 mL含尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和2′-脱氧腺苷分别为494.5、185.2、479.5、517.5和189.2 μg的对照品储备液。分别取各对照品储备液适量，加水制成每1 mL含上述5个成分分别为49.45、18.52、47.95、51.75和18.92 μg的混合溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液取本品粉末（过3号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20%甲醇10 mL，称量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz，20 ℃以下）30 min，再称量，用20%甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2 色谱条件与系统适用性采用Agilent ZOBAX SB-AQ C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0~5 min，0%A；5~15 min，0%A→10%A；15~30 min，10%A），柱温30 ℃，检测波长260 nm，进样量5 μL。各峰与邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按腺苷计算在6 000以上。对照品及样品的色谱图见图 1。
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1.尿苷（uridine）2.肌苷（inosine）3.鸟苷（guanosine）4.腺苷（adenosine）5. 2′-脱氧腺苷（2′-deoxyadenosine） 图 1 混合对照品（A）及RG-5号冬虫夏草（B）HPLC图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Cordyceps sinensis sample No. RG-5(B) |
精密吸取各对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分别置于5个10 mL量瓶中，加20%甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取上述混合对照品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，以各对照品质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表 1，表明各化合物在相应线性范围内线性关系良好。
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表 1 各被测成分的回归方程、相关系数（r）和线性范围 Table 1 Regression equations, correlation coefficients(r), linear ranges of the investigated components |
精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液5 μL，按“2.2”项下色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积。结果尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和2′-脱氧腺苷峰面积的RSD（n=6）分别为0.46%、0.88%、0.69%、1.0%和0.92%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 重复性试验取同一批样品（YS-1号样品）粉末6份，每份0.2 g，精密称定，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量。结果样品中尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和2′-脱氧腺苷平均含量（n=6）分别为0.210%、0.101%、0.138%、0.058%和0.003%，RSD分别为0.95%、1.2%、0.98%、1.2%和1.4%，表明重复性良好。
2.3.4 稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液（YS-1号样品）5 μL，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和2′-脱氧腺苷峰面积的RSD（n=6）分别为0.97%、1.2%、1.0%、0.78%和0.58%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.5 加样回收率试验精密称取已知含量的YS-1号样品粉末6份，每份约0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入各对照品溶液（尿苷201.0 μg·mL-1, 肌苷193.6 μg·mL-1，鸟苷93.50 μg·mL-1，腺苷71.05 μg·mL-1，2′-脱氧腺苷11.05 μg·mL-1）各1 mL，分别按照“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率，结果尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和2′-脱氧腺苷平均加样回收率（n=6）分别为98.3%、101.3%、100.6%、98.8%和101.1%，RSD分别为1.6%、1.3%、1.1%、1.4%和1.7%。
2.4 校正因子重现性考察 2.4.1 高效液相色谱仪及色谱柱考察试验考察采用Thermo Ulitimate 3000、Waters H-Class和Agilent 1260型3台高效液相色谱系统和Agilent ZOBAX SB-AQ（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Waters ACQUITY HSS T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），SHIMADZU InertSustain AQ-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）3种色谱柱时的相对校正因子（相对校正因子=Ai×Cs/As×Ci，式中As为待测成分s的峰面积，Cs为质量浓度；Ai为内参物i的峰面积，Ci为质量浓度）。结果（表 2）表明，采用不同的色谱柱及高效液相色谱仪，相对校正因子具有较好的重现性，能够用于上述5个核苷的含量测定。
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表 2 不同仪器和色谱柱测得的相对校正因子 Table 2 The relative correction factor(RCF)obtained from different equipmens and columns |
本研究采用各待测成分间的相对保留值（待测成分与内参物调整保留时间之比）作为定位标准，并在不同品牌高效液相色谱系统和不同色谱柱下对该参数进行考察。结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分间的相对保留值波动较小，RSD在1.2%~3.2%，见表 3。结果说明，在对照品短缺的情况下，利用相对保留值进行色谱峰定位，可根据内参物的保留时间，结合各色谱峰的紫外吸收特征及相对保留值，能够较准确地确定目标峰的位置。因此选用各成分相对保留值这一参数作为冬虫夏草中上述5个目标色谱峰的定位指标比较合理。
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表 3 不同仪器和色谱柱下目标成分的相对保留时间 Table 3 The relative retention time obtained from different equipments and columns |
分别取野生冬虫夏草和人工繁育品约0.2 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进行测定，采用外标法和一测多评法计算冬虫夏草中尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和2′-脱氧腺苷含量，见表 4。经t检验比较，结果显示常规的外标法实测含量值与一测多评法计算的含量无显著性差异，说明一测多评法可用于冬虫夏草的多成分质量评价研究。
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表 4 外标法（ESM）和一测多评法（QAMS）测定冬虫夏草中5个核苷的含量（%，n=2） Table 4 The content of five nucleosides in Cordyceps sinensis(BerK.) Sacc.by external standard method(ESM) and quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS) |
采用一测多评校正因子进行样品含量计算，由于在不同波长下偏差较大，如何选定适合的波长对降低测定误差很关键。经二极管阵列检测器分析，尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和2′-脱氧腺苷的最大吸收波长分别为262、248、254、260和260 nm，综合考虑5个成分，结果发现在260 nm处上述5个成分均具有较大吸收且色谱峰分离度均大于1.5，达到色谱分析要求，因此选用260 nm作为检测波长。
本研究同时考察了Thermo Ulitimate 3000、Waters H-Class和Agilent 1260型3台高效液相色谱仪以及不同品牌的3根色谱柱，结果由表 2和表 3可看出，尿苷、肌苷、鸟苷和2′-脱氧腺苷成分和内参物腺苷之间的相对校正因子重现性良好，说明一测多评法对冬虫夏草中5个核苷类成分含量的测定具有可行性。
分别采用外标法和一测多评法对10批冬虫夏草人工繁育品和10批野生品中5个核苷的含量测定结果进行比较分析，采用相对平均偏差比较2种方法的准确性，2种方法对同一样品的测定结果之间的相对平均偏差均在3%以内，表明2种测定方法所得结果具有较好的重现性，一测多评法可用于冬虫夏草中5个核苷类成分的含量测定。
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