2018, Vol. 38 
2. 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 南京 210023;
3. 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心, 南京 210023
2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, China;
3. National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing 210023, China
牡丹皮为毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，性苦、辛，微寒，有清热凉血及活血化瘀之效[1]。目前已从牡丹皮中鉴定出的化学成分有50多个[2]，Xu等[3]曾采用HPLC-DAD/ESI-MS2技术鉴定出了17个单萜苷类成分、14个没食子酸糖苷类成分、5个酚酸类成分、3个黄酮类成分、1个三萜类成分，He等[4]采用HPLC-DAD-ESI/MS2技术对牡丹皮进行质量评价，共指认出了19个共有峰成分，并对5个成分进行了定量测定。关于牡丹皮的质控方法大多选择丹皮酚、芍药苷及没食子酸等少数几个指标性成分[5-8]，中药材的药效是内部所有化学成分综合作用的结果，因此单一或少数几个指标性成分无法代表中药材的总体质量。近年来，超高效液相色谱（UPLC）串联三重四极杆质谱（TQ-MS）因具有分离速度快，灵敏度高，准确性强的特点，被广泛应用于中药材的分析中[9-10]，故本文建立了基于UPLC-TQ-MS方法的多指标综合评价牡丹皮药材质量的方法，以期为牡丹皮药材及其成药的质量控制提供依据。
1 仪器与试药Waters公司ACQUITY UPLC系统（二元高压泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器）；Waters公司Xevo TQ/MS质谱系统；Waters公司MassLynxTM质谱工作站；梅特勒-托尼多仪器有限公司ML204电子分析天平（1/10万），MS105电子分析天平（1/1万）；Millipore公司Millipore Q纯水系统；昆山禾创超声仪器有限公司KQ-250E型超声波清洗器；上海安亭科学仪器厂Anke GL-16GⅡ型离心机。
对照品丹皮酚（批号DPF20160828）、没食子酸（批号MSZS20140901）、芍药苷（批号SYG20160108）、五没食子酰葡萄糖（批号QMTT20160811）、没食子酸甲酯（批号MSJZ20161013）、苯甲酰芍药苷（批号BJYG20161011）、三没食子酰葡萄糖（批号SMTT20161213）、没食子酰芍药苷（批号MSYG20160601）、氧化芍药苷（批号YHYG20151121）、芍药苷元（批号SYGY20160313）、香草乙酮（批号XCYT20161102）、儿茶素（批号ECS20160315）、对羟基苯甲酸（批号DQJS20141212）、6-羟基香豆素（批号QJDS20160921）、牡丹皮苷C（批号MDGC20151211）、丹皮酚原苷（批号DPYG20161220）、槲皮素（批号HPS20160618）、芍药苷亚硫酸酯（批号160703）均购自南京春秋生物工程有限公司，纯度均≥98%；甲醇（南京化学试剂有限公司）为分析纯，乙腈（Merck公司）及甲酸（ACS公司）均为色谱纯，超纯水由Milli-Q纯水机制备。
牡丹皮药材购于安徽亳州康美中药城，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，共采集了20批样品，编号S1~S20；其中S1~S10为硫熏样品，S11~S20为未硫熏样品，凭证标本存放于江苏省中药资源产业化过程协同创新中心。
2 方法与结果 2.1 混合对照品工作液的制备分别精密称取丹皮酚、没食子酸、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯、苯甲酰芍药苷、三没食子酰葡萄糖、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、芍药苷元、香草乙酮、儿茶素、对羟基苯甲酸、6-羟基香豆素、牡丹皮苷C、丹皮酚原苷、槲皮素、芍药苷亚硫酸酯的的对照品适量，以甲醇溶解并定容制成各对照品储备液。精密量取各成分对照品储备液适量，置于同一量瓶中，制成混合对照品溶液，其中上述各成分的质量浓度分别为129.4、122.2、121.4、99.4、179.4、110.6、100.6、100.7、95.6、111.1、100.0、109.1、125.7、120.3、63.6、72.4、91.6和123.9 μg·mL-1。并将上述混合对照品溶液用甲醇稀释成6份不同浓度（稀释2、10、20、100、200、1 000倍）的混合对照品工作液。
2.2 供试品溶液的制备取牡丹皮药材粉末（过4号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）45 min，放至室温，称定质量，用甲醇补足减失的的质量，摇匀，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.3 色谱及质谱条件色谱分析条件：采用Waters Acquity UPLC HSS BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0~5 min，95%A→90%A；5~7 min，90%A→75%A；7~10 min，75%A→50%A；10~15 min，50%A→5%A），流速0.4 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量3 μL。进样前以流动相梯度初始条件平衡5 min。
质谱检测条件：ESI源；扫描方式为ESI+、ESI-模式；多反应监测（MRM）；毛细管电压3 kV，锥孔电压20 V，萃取电压3 V，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔气流量50 L·h-1，脱溶剂气流量1 000 L· h-1，辅助气流0.15 mL·min-1；各待测成分的质谱参数见表 1，色谱图见图 1。
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表 1 待测成分MRM参数 Table 1 MRM parameters of the component to be tested |
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图 1 样品中各待测成分MRM色谱图 Figure 1 MRM chromatogram of each analyte in the sample |
精密量取“2.1”项下系列混合对照品工作液3 μL，按“2.3”项下的分析条件进行测定。以被测化合物质量浓度X为横坐标，相应峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，并按信噪比（S/N）为10和3分别计算被测成分的定量下限（LOQ）和检测下限（LOD）。结果见表 2，各成分线性良好，r2值均在0.992 3以上。
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表 2 回归方程、线性范围、检测下限与定量下限 Table 2 Regression equation, linear range, LOD and LOQ |
取中浓度（稀释20倍）混合对照品工作液，在上述色谱条件下连续进行6次以测定待测成分的峰面积，以各指标成分峰面积的RSD评价精密度。结果见表 3。
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表 3 方法学考察 Table 3 Methodological study |
取S1号样品6份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样分析，计算各成分的含量，以含量的RSD评价重复性，结果见表 3。
2.4.4 稳定性试验取S1号样品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定，以样品中各指标成分峰面积计算RSD，结果见表 3。
2.4.5 加样回收率试验取0.5 g已知含量的S1号样品6份，每份精密称定，加入与样品中各成分含量相近的各对照品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液并按上述条件测定，计算平均回收率和RSD。结果见表 3。
3 结果与分析 3.1 测定结果各样品按照“2.2”项下的方法制得供试品溶液，并按“2.3”项条件下进行测定，结果见表 4。
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表 4 不同批次牡丹皮样品中待测成分的含量（mg·g-1，n=3） Table 4 The content of the substance in different batches of Cortex Moutan |
将20批次牡丹皮样品中18个化学成分含量数据生成二维数据矩阵，经UV标准化处理后导入SIMCA-P+13.0（Umetrics AB，Umea，瑞典）软件，利用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）建立分析模型。
绘制OPLS-DA得分图，如图 2，该图表明20批牡丹皮样品被t[2]轴明显区分为22个区域，且恰好分为硫熏（S）与未硫熏（W）2组，初步显示硫熏加工会导致牡丹皮内在化学成分发生较大的变化。
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W.未硫熏（not sulfur smoked）S.硫熏（sulfur smoked） 图 2 OPLS-DA得分图 Figure 2 Score plot of OPLS-DA |
VIP值是OPLS-DA中评价变量对分类的贡献所常用的方法，一般认为VIP > 1的变量为组间的特征性成分，具有统计学意义[11]。以7倍交叉验证（7-fold cross validation）得到的评价模型的参数解释率（R2Y）为97.2%，模型预测率（Q2）为93.2%，并以此为标准，结合VIP图（图 3），筛选出对硫熏样品与未硫熏样品分组贡献较大的差异性成分。图 3显示，芍药苷亚硫酸酯、槲皮素、儿茶素、氧化芍药苷、没食子酸、没食子酸甲酯的VIP值> 1，说明牡丹皮药材经硫后上述几个化学成分的含量存在显著差异。
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1.丹皮酚(paeonol)2.没食子酸(gallic acid)3.芍药苷(paeoniflorin)4.五没食子酰葡萄糖(1, 2, 3, 4, 6-pentagalloylglucose)5.没食子酸甲酯(methyl gallate)6.苯甲酰芍药苷(benzoyl paeoniflorin)7.三没食子酰葡萄糖(1, 3, 6-tri-O-galloyl-beta-D-glucose)8.没食子酰芍药苷(galloyl-paeoniflorin)9.氧化芍药苷(oxypaeoniflora)10.芍药苷元(paeoniflorigenone)11.香草乙酮(acetovanillone)12.儿茶素(catechin)13.对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)14. 6-羟基香豆素(6-hydroxycoumarin)15.牡丹皮苷C(cortexidin C)16.丹皮酚原苷(paeonolide)17.槲皮素(quercetin)18.芍药苷亚硫酸酯(paeoniflorin sulfite) 图 3 牡丹皮中18个化学成分VIP图 Figure 3 VIP values of 18 constituents in Cortex Moutan |
本研究曾尝试采用水蒸气蒸馏提取法和超声提取法2种方法制备供试品溶液，并分别考察了不同提取时间对测定结果的影响。结果表明用超声提取法，提取有效成分更加完全，且杂质含量较少。
4.2 讨论近年来，大量文献报道称，硫熏会导致药材内部化学成分发生改变[12-15]，并残留一定量的二氧化硫以及含硫衍生物，存在安全隐患，李秀杨等采用UPLC-QTOF-MS/MS技术推测牡丹皮硫熏后产生特征性含硫成分芍药苷亚硫酸酯[16]。结合本研究测定结果，芍药苷亚硫酸酯在硫熏前后含量变化最为显著，因此本研究建议将芍药苷亚硫酸酯列为牡丹皮药材硫熏质控指标。
除此之外，牡丹皮经硫熏后，槲皮素、儿茶素、没食子酸含量显著升高，氧化芍药苷、没食子酸甲酯的含量显著降低；其中，槲皮素、儿茶素为黄酮类成分，在牡丹皮中含量较低，不是主要活性成分；没食子酸为有机酸，具有抗氧化、抗炎等药理活性，是牡丹皮中研究较广泛的化学成分之一；氧化芍药苷与没食子酸甲酯的含量也相对较低，且少见其药理活性的报道。
4.3 小结本研究利用UPLC-TQ-MS串联技术对牡丹皮药材中18个化学成分的含量进行测定分析，建立了一种全面、科学的测定方法，为综合评价牡丹皮药材质量提供切实可靠的参考；经OPLS-DA变量统计分析，指认出牡丹皮硫熏前后含量差异显著的6个指标性成分（芍药苷亚硫酸酯、槲皮素、儿茶素、氧化芍药苷、没食子酸、没食子酸甲酯），为牡丹皮药材质量控制提供依据。
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