2018, Vol. 38 
2. 河北楚风中药饮片有限公司, 安国 071200;
3. 上海中医药大学附属龙华医院, 上海 200032
2. Hebei Chufeng Chinese Herbal Medicine Co. Ltd., Anguo 071200, China;
3. Longhua Hospital Affiliated to Shanghai Univesity of TCM, Shanghai 200032, China
苍术是菊科植物茅苍术 Atractylodes lancea（Thunb.）DC.和北苍术 Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根茎，两者被同时作为苍术基源[1]。茅苍术别名南苍术，主产于江苏、湖北等地，野生资源稀少，目前在湖北英山具有规模化种植基地[2]。北苍术一般为野生资源，分布于河北、吉林、内蒙古等地区[3]。关苍术为菊科植物关苍术 Atractylodes japonica Koidz. ex Kitam.，收录于日本药局方，分布于黑龙江、吉林等地区及北朝鲜，含有较高的白术内酯Ⅱ，而不含或几乎不含苍术素[3]，未被《中华人民共和国药典》（2015年版）收载。
苍术化学成分主要为挥发油，包括β-桉叶醇、茅术醇、白术内酯Ⅰ、苍术酮等倍半萜类及倍半萜内酯类，苍术素、苍术素醇等聚炔类成分等。其中苍术素为《中华人民共和国药典》（2015年版）规定的苍术指标性成分。苍术具有促进胃肠运动，抗溃疡，抗炎，抑菌，降血糖，抗心律失常，抗肿瘤等药理作用[3-5]。
苍术资源分布广泛，不同产地、不同地理环境下的苍术化学成分含量差异明显，对苍术药材的质量控制造成一定困难。而通过外观形态难以区分苍术的种及质量优劣，导致药材混杂的现象较为普遍[6-7]。因此，开展对苍术质量控制和品质评价研究具有重要意义。本文以40批苍术药材为研究对象，采用高效液相色谱法对药材中的7个主要成分（白术内酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ及（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯、苍术素、β-桉叶醇、苍术酮）进行定量分析，并结合主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least square discrimination analysis，OPLS-DA）的方法对定量结果进行统计分析，对茅苍术、北苍术和关苍术进行分类并寻找潜在的差异性成分，对苍术药材质量进行综合评价，以期为苍术药材的质量控制与评价提供科学依据[7-8]。
1 仪器与试药Agilent 1260型高效液相色谱仪（Agilent公司），AL104电子天平（梅特勒公司），DL-120D智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司），5424R冷冻离心机（Eppendorf公司），Research plus移液枪（Eppendorf公司），Milli-Q超纯水机（Millipore公司）。
甲醇为色谱纯，磷酸等试剂均为分析纯，均购于国药集团有限公司。
对照品白术内酯Ⅲ（HPLC测定含量≥98%，批号ZM0311BD13）、白术内酯Ⅱ（HPLC测定含量≥98%，批号PA0808RA13）、白术内酯Ⅰ（HPLC测定含量≥98%，批号Z20J7B16421）、苍术素（HPLC测定含量≥98%，批号Z27M7S15379）、β-桉叶醇（HPLC测定含量≥98%，批号P27A7F20168）、苍术酮（HPLC测定含量≥98%，批号P06A8F33355）均购自上海源叶生物科技有限公司，（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯（HPLC测定含量≥98%，批号17-2003）购自上海中药标准化研究中心。
11批茅苍术药材（1~11号样品）收集于湖北英山、随州等地，21批北苍术药材（12~32号样品）收集于内蒙、辽宁、山西、河北等地，8批关苍术药材（33~40号样品）收集于吉林、朝鲜等地，药材经上海中医药大学中药学院赵志礼教授鉴定。
2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 对照品储备液精密称取白术内酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ及（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯、苍术素、β-桉叶醇、苍术酮的对照品适量，分别置于棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，分别配制成质量浓度为1.035、2.01、2.205、2.058、1.28、3.02、3.74 mg·mL-1的溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液取苍术样品粉末（过60目筛）约1.0 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇水25 mL，密塞，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）提取45 min，放冷，再次称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.2 色谱条件采用资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）为流动相，梯度洗脱（0~5 min，45%B→55%B；5~7 min，55%B→68%B；7~35 min，68%B→75%B；35~36 min，75%B→78%B；36~48 min，78%B；48~50 min，78%B→95%B；50~60 min，95%B；60~62 min，95%B→100%B；62~77 min，100%B），检测波长220 nm（0~28 min，检测白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ）、270 nm（28~40 min，检测白术内酯Ⅰ、（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯）、203 nm（40~50 min，检测苍术素、β-桉叶醇）、220 nm（50~77 min，检测苍术酮），流速为1.0 mL·min-1，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。对照品及3种样品色谱图见图 1。
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1.白术内酯Ⅲ（atractylenolide Ⅲ）2.白术内酯Ⅱ（atractylenolide Ⅱ）3.白术内酯Ⅰ（atractylenolide Ⅰ）4.（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯（（4E，6E，12E）-tetradecatriene-8，10-diyne-1，3-diacetate）5.苍术素（atractylodin）6.β-桉叶醇（β-eudesmol）7.苍术酮（atractylon） 图 1 混合对照品（A）、15号北苍术样品（B）、37号关苍术样品（C）和3号茅苍术样品（D）色谱图 Figure 1 Chromatograms of mixed reference substances(A), A. chinensis sample No. 15(B), A. japonica sample No. 37(C) and A. lancea sample No. 3(D) |
茅苍术样品的β-桉叶醇分离度不佳，因此对其β-桉叶醇含量进行单独测定并通过方法学验证。色谱条件：采用资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.1%磷酸水溶液-甲醇（20:80），等度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃，检测波长203 nm，进样量5 μL。对照品及样品色谱图见图 2。
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1. β-桉叶醇（β-eudesmol） 图 2 对照品（A）和3号茅苍术样品（B）色谱图 Figure 2 Chromatograms of reference substance(A) and A. lancea sample No. 3 (B) |
精密量取白术内酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ及（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯、苍术素、β-桉叶醇、苍术酮的对照品储备液适量，用甲醇配制成质量浓度分别为0.041 4、0.080 4、0.088 2、0.082 3、0.320 0、0.845 6、0.935 0 mg·mL-1的混合对照品溶液；用流动相将上述混合对照品溶液稀释2、4、20、50、100、200倍，得到系列浓度的混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以对照品质量X（μg）及峰面积值Y进行线性回归，分别以S/N=10及S/N=3求得各组分的定量下限及检测下限，结果见表 1。
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表 1 7个成分的线性关系及定量下限、检测下限 Table 1 Linearity, LOQs and LODs of seven components |
另精密量取β-桉叶醇的对照品储备液（2.68 mg·mL-1）适量，用流动相稀释得到系列浓度的β-桉叶醇对照品溶液，按茅苍术样品中β-桉叶醇含量测定的色谱条件进样测定，得回归方程：
Y=1 075.5X+33.701 r=0.999 9
2.4 精密度试验精密吸取混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录白术内酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ及（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯、苍术素、β-桉叶醇、苍术酮的峰面积，计算峰面积的RSD（n=6）分别为1.4%、1.6%、1.0%、1.9%、0.89%、1.7%、1.3%。用β-桉叶醇对照品溶液（0.268 0 mg·mL-1）进行茅苍术样品中β-桉叶醇含量测定的精密度试验，RSD为1.5%。结果表明仪器精密度良好。
2.5 重复性试验精密称取15号苍术样品，按“2.1.2”项方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析，计算白术内酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ及（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯、苍术素、β-桉叶醇、苍术酮的平均含量值（以干燥品计）分别为0.657、0.592、0.863、0.095、1.211、0.972、2.554 mg·g-1，RSD分别为1.3%、0.97%、1.1%、1.8%、2.3%、2.0%、1.7%。用3号样品进行茅苍术样品中β-桉叶醇含量测定的重复性试验，RSD为1.1%。结果表明方法重复性良好。
2.6 稳定性试验取15号苍术样品的供试品溶液，室温放置，分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.2”项下色谱条件进样分析，计算24 h内供试品溶液中白术内酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ及（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯、苍术素、β-桉叶醇、苍术酮峰面积的RSD分别为0.67%、1.0%、0.78%、1.5%、0.38%、1.7%、0.89%。用3号样品进行茅苍术样品中β-桉叶醇含量测定的稳定性试验，峰面积的RSD为2.3%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 加样回收率试验精密称取15号苍术样品6份，每份约0.5 g，分别加入混合对照品溶液（每1 mL含白术内酯Ⅲ 0.240 8 mg，白术内酯Ⅱ 0.224 0 mg，白术内酯Ⅰ 0.329 2 mg，（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯0.037 75 mg，苍术素0.492 0 mg，β-桉叶醇0.383 0 mg，苍术酮0.932 5 mg）适量，按“2.1.2”项方法制备供试溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析并计算回收率，结果见表 2。用3号样品进行茅苍术样品中β-桉叶醇含量测定的加样回收率试验，结果平均回收率为100.6%，RSD为2.3%。结果表明本法回收率良好。
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表 2 加样回收率结果（n=6） Table 2 Results of recovery test for seven components of Atractylodes samples |
取不同批次苍术样品，分别按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析（茅苍术样品中β-桉叶醇含量单独分析）。按外标峰面积法计算样品中各测定成分的含量（以干燥品计），结果见表 3。
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表 3 样品的含量测定（mg·g-1） Table 3 Determination results of Atractylodes samples |
采用SIMCA 13.0软件，对40批样本的7个主要成分含量进行无监督模式PCA分析。所得PCA得分图见图 3。拟合主成分个数为2个，前2个主成分的累计方差贡献率为77.5%。从图 3可以看出，40批样品可以分为4组，其中组1和组4均为北苍术，组2为关苍术，组3为茅苍术。PCA分析可较好地区分茅苍术、北苍术和关苍术。
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图 3 PCA得分散点图 Figure 3 Score scatter plot of PCA |
在PCA分析的基础上，以样本中各成分的含量为自变量，样本类别为因变量建立OPLS-DA判别模型进行分析，利用变量权重重要性排序（variable importance in projection，VIP）对组间差异性成分进行筛选和指认。
对3个种的苍术样本进行OPLS-DA分析。以2个预测成分和1个正交成分建立模型，结果R2Y（cum）=0.878，Q2（cum）=0.852，模型拟合及预测效果良好。VIP大于1的成分分别为苍术素（P5）和β-桉叶醇（P6），见图 4。
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图 4 VIP图（3种苍术） Figure 4 VIP plot of OPLS-DA (three kinds of Atractylodes) |
对2组北苍术样品（组1和组4）进行OPLS-DA分析。以1个预测成分和1个正交成分建立模型，结果R2（cum）=0.852，Q2（cum）=0.781，模型拟合及预测效果良好。VIP大于1的成分分别为白术内酯Ⅲ（P1）、白术内酯Ⅱ（P2）、白术内酯Ⅰ（P3）和苍术素（P5），见图 5。
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图 5 VIP图（2组北苍术） Figure 5 VIP plot of OPLS-DA (two groups of A. chinensis) |
在OPLS-DA分析的基础上，选取OPLS-DA分析所得的VIP值大于1的成分，以样本类别为自变量，样本中各成分的含量为因变量进行单因素方差分析和独立样本t检验（P < 0.05为差异有统计学意义）。
通过单因素方差分析比较3个种苍术之间的苍术素、β-桉叶醇含量，结果发现3组之间苍术素和β-桉叶醇含量均存在显著性差异（P < 0.01）。通过独立样本t检验比较2组北苍术样本之间的白术内酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ和苍术素含量，结果发现2组之间的白术内酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ和苍术素含量均存在显著性差异（P < 0.01）。
对筛选的2个差异性成分在北苍术、茅苍术和关苍术中的分布进行比较，结果显示，苍术素在关苍术中含量最低，在茅苍术中含量较高。苍术素在北苍术中的分布较不均匀，其中部分北苍术（组4）的苍术素含量高于茅苍术，部分北苍术（组1）苍术素含量低于茅苍术但高于关苍术。β-桉叶醇在关苍术中含量最低，在北苍术中含量较低，在茅苍术中含量最高。因此可将苍术素、β-桉叶醇作为关键的差异性成分鉴别关苍术、北苍术和茅苍术。
对筛选的4个差异性成分在两组北苍术（组1和组4）中的分布进行比较，结果显示，白术内酯Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ在组4中含量均较低，在组1中含量均较高。苍术素在组1中含量较低，在组4中含量较高。原因可能是北苍术药材多为野生资源，不同产地及不同地理环境下苍术化学成分含量具有明显差异，因此有必要对苍术药材进行质量控制研究。
4 讨论与小结 4.1 测定方法的建立本研究建立HPLC法同时测定苍术药材中7个主要成分含量，并进行PCA和OPLS-DA分析。研究过程中对苍术药材的提取条件、检测波长进行了考察。
采用不同体积百分数（50%、70%、90%、100%）甲醇和水超声提取，结果90%甲醇水超声提取效率最佳。比较30、45、60 min超声提取时间，45 min的提取效率最佳。
经紫外全波长扫描确定，白术内酯Ⅲ、Ⅱ和苍术酮的最大吸收波长为220 nm[9-10]，白术内酯Ⅰ的最大吸收波长为278 nm，（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯的最大吸收波长为250 nm和315 nm 2个波长；由于两者保留时间较为接近，故选择在同一波长270 nm下进行检测[9, 11]。β-桉叶醇为紫外末端吸收，苍术素的最大吸收波长为335 nm，由于苍术素和β-桉叶醇的保留时间接近，故选择同一波长203 nm下检测苍术素和β-桉叶醇[12-14]。因此最终确定白术内酯Ⅲ、Ⅱ和苍术酮的检测波长为220 nm，白术内酯Ⅰ、（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯的检测波长为270 nm，苍术素和β-桉叶醇的检测波长为203 nm。在此波长梯度条件下，7个成分均有较强的吸收，各成分能得到有效分离和检测。但茅苍术样品中某组分对β-桉叶醇有干扰，反复改变条件也无法达到定量要求，只能改变色谱条件，对茅苍术中的β-桉叶醇进行单独测定。
4.2 多元统计分析和意义本研究结合PCA和OPLS-DA多元统计方法，对40批苍术样本的7个主要成分含量进行数据分析，实现茅苍术、北苍术和关苍术的区分，并揭示苍术素和β-桉叶醇是区分3种苍术关键的差异成分。茅苍术产地为湖北不同地区，分布较集中，质量相对较稳定，平均质量较高。北苍术多为野生资源，化学成分含量和药材质量差异较大，因此有必要对其进行质量控制。
综上，本文研究3种苍术的7个主要成分含量并对其进行多元统计分析，希冀为苍术质量控制和评价的深入研究奠定基础。
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