2018, Vol. 38 
药品直接接触包装材料（容器）是药品重要的组成部分，微生物污染的评价是药品包装材料质量和安全性评价的重要指标[1-3]。由于药品包装材料无法直接溶解制成供试品溶液，因此包装材料需要一定的前处理，将其表面的微生物尽可能采集制成供试液再进行微生物限度检查[4-5]。适宜的样品前处理方法能真实有效地反映药品包装材料的微生物污染情况，以控制其污染因素，保证药品质量。本实验采用的药用复合膜、铝箔、硬片3种药用包材，国家标准中微生物限度技术要求为：需氧菌不得过1 000 CFU/100 cm2；霉菌、酵母菌不得过100 CFU/100 cm2[6]，但实际产品生物负载水平很小。因此，参照ISO11737-1生物负荷技术验证的产品接种方法，将已知数目的菌悬液涂在包材表面，形成人工负载[7]，然后用国家药包材标准中药用膜/片包装材料中常用的棉签擦拭和自行设计的振荡洗涤2种方法分别制备供试液，再按照中国药典2015年版四部通则1105采用薄膜过滤法进行微生物计数试验，并对结果进行分析比较[8-12]。
1 仪器与材料 1.1 仪器生化培养箱Thermo815（赛默飞世尔）；高压蒸汽灭菌MLS-3780（三洋）；电子天平CP622（赛多利斯）；ESCO生物安全柜Class Ⅱ BSC（艺思高科技有限公司）；XW-80A微型旋涡混合仪（天津市一瑞化学试剂有限公司）。
1.2 实验用标准菌株生物梅里埃定量质控菌株BioBall MultiShot 550系列，包括金黄色葡萄球菌NCTC 10788（批号：B3651）、铜绿假单胞菌NCTC 12924（批号：B3653）、枯草芽孢杆菌NCTC 10400（批号：B3647）、白色念珠菌NCPF 3179（批号：B3663）、黑曲霉NCPF 2275（批号：B3642）。
1.3 培养基及试剂胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）干粉（上海中科昆虫生物技术开发有限公司，批号：151002）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）干粉（上海中科昆虫生物技术开发有限公司，批号：151016）、氯化钠注射液（上海长征富民金山制药有限公司，批号：150623）。上述培养基适合性检查符合规定。
1.4 实验样品样品双向拉伸聚酯/铝/流延聚丙烯药用复合膜（批号：201602153）、药用铝箔（批号：201601603）、聚氯乙烯固体药用硬片（批号：201601913），均为日常检测用样品（批号为本实验室检测样品内部编号）。
2 方法 2.1 菌液制备将不同种类的BioBall MultiShot 550标准菌株球分别倒入1.1 mL 14 d复溶液中，旋涡混匀5 s，即为实验用菌液（500 cfu·mL-1标准菌株实验用菌液）。
2.2 人工负载菌株样品的制备取双向拉伸聚酯/铝/流延聚丙烯药用复合膜，用4 cm×5 cm的模板裁取11片，将裁取的样品进行灭菌处理，然后每片加制备好的Bioball金黄色葡萄球菌悬液（500 cfu·mL-1）40 μL用涂布棒涂匀，并将第一片丢弃，再将涂布好的片材置于生物安全柜中，40 min左右自然干燥。依次同法制备铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的人工负载样品。
再分别取药用铝箔、聚氯乙烯固体药用硬片，同法制备各菌株人工负载样品。
2.3 供试液及滤膜制备试验组A（棉签擦拭）：按不同菌株分别取“2.2”项下试样5片，每片试样分别用氯化钠注射液沾湿的无菌棉签来回擦抹5次，换1支棉签同法操作，即每个位置用2支棉签共擦抹10次。每支棉签抹完后立即剪断，投入含有30 mL氯化钠注射液的锥形瓶中，将全部擦抹棉签投入瓶中后，将瓶迅速摇晃1 min，即得1:30供试品溶液。分别取1:30供试品溶液30 mL进行薄膜过滤，再分别用50 mL氯化钠注射液冲洗棉签3次，过滤。取滤膜照中国药典2015年版四部通则1105依法检查。
试验组B（洗涤振荡）：按不同菌株分别取“2.2”项下试样5片放入无菌的锥型瓶中，加入30 mL的0.9%氯化钠注射液，在微型旋涡混合仪（2 800 r·min-1）上振荡1 min。取供试液进行薄膜过滤后，再分别用50 mL氯化钠注射液冲洗试样3次，过滤。取滤膜照中国药典2015年版四部通则1105依法检查。
菌液对照组：取200 μL实验用菌液（含500 cfu·mL-1标准菌株）直接加入30 mL 0.9%氯化钠注射液中，摇晃1 min后，同法进行薄膜过滤。
试验组A、试验组B及菌液对照组同时进行1组独立实验。每种样品按上述步骤取5种菌分别进行6组平行独立实验，分别计算回收率。
2.4 计数方法金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌：取滤膜贴在TSA平板培养基表面，30~35℃培养，在3 d之内逐日进行计数；白色念珠菌、黑曲霉：取滤膜贴在SDA平板培养基表面，20~25℃培养，在5 d内逐日进行计数。
2.5 回收率计算回收率=实验组菌落数/菌液对照组菌落数×100%
3 结果 3.1 棉签擦拭法菌落计数回收率测定2种方法各菌落计数检查回收率测定结果如表 1~2所示。棉签擦拭法的回收率范围为50%~60%，洗涤振荡法回收率范围为87%~100%，均符合药典规定的50%~200%的范围，但棉签擦拭法的回收率均较低。
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表 1 洗涤振荡法菌落计数回收率测定结果（n=6） Table 1 Recovery results by shaking and washing method to colony enumeration |
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表 2 棉签擦拭法菌落计数回收率测定结果（n=6） Table 2 Recovery results by cotton swab wipe method to colony enumeration |
以不同品种的样品及不同供试液制备方法为两因素，分别对各菌株的回收率进行双因素方差分析，结果表 3所示。试验结果表明，不同供试液制备方法对各菌株回收率有显著性差异，而不同样品对菌株回收率均无显著性差异。
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表 3 各菌株回收率统计学检验结果 Table 3 Statistical results of the recovery rate for each strain |
本文采用2种不同的供试液制备方法（棉签擦拭法及洗涤振荡法）对药品包装用膜/片材进行需氧菌和霉菌及酵母菌计数测定，并对结果进行回收率计算。试验结果表明，采用洗涤振荡法比棉签擦拭法获得更为理想的回收率。统计学分析结果表明两者具有显著性差异，即采用洗涤振荡法制备供试液得到的微生物计数回收率将显著提高。
棉签擦拭法是先将微生物转移至棉签上，再将棉签上的微生物洗脱至供试液中。首先，棉签本身会吸附一部分微生物，使其在转移至洗脱液过程中出现损失，当样品中微生物个数较少时，可能出现假阴性检测结果；其次，棉签在样品表面的反复擦拭可能造成微生物的损伤，使微生物生长缓慢，在规定培养时间内无法检出[13-15]；另外在实际操作过程中，剪断棉签时易弹出容器外，操作不便。以上问题都将对检验结果造成影响。洗涤振荡法是将片材表面的微生物直接洗脱至供试液中，操作简便，避免了微生物在不同材料中的2次转移，同时也避免了微生物的机械损伤，提高了检验结果的可靠性。
对于药品包装用材料，只有合理的供试液制备方法才能真实有效地反映药品包装材料上微生物的实际数量，这对控制产品微生物污染具有积极意义。综上，在片状包材微生物限度检查过程中，采用本文中的洗涤振荡法进行供试液制备比传统的棉签擦拭法更为合理可行。
本实验采用的洗涤振荡法是基于棉签擦拭法制备供试液时迅速摇晃1 min而设计，考虑到手工摇晃的不确定性而采用在微型旋涡混合仪（2 800 r·min-1）上振荡1 min。但有资料显示，不同的振荡条件对材料表面上微生物的洗脱效果是不一样的[16]，今后应对振荡洗涤条件进一步作优化研究。
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