2018, Vol. 38 
2. 唐山市第二医院药剂科, 唐山 063000;
3. 解放军白求恩国际和平医院药剂科, 石家庄 050082;
4. 中国石油天然气集团公司中心医院药学部, 廊坊 065000
2. Pharmacy Department, the Second Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, China;
3. Pharmacy Department, Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China;
4. Pharmaceutical Department, China National Petroleum Corporation Center Hospital, Langfang 065000, China
磺丁基醚-β-环糊精（betadex sulfobutyl ether sodium，SBE-β-CD）是一种肾毒性小、水溶性好、溶血作用小的优良药用辅料，由1，4-丁烷磺内酯（1，4-BS）在碱性条件下与β-CD的2，3，6位碳上的羟基发生取代反应而得[1-7]。4-羟基丁磺酸为原料1，4-BS和目标化合物SBE-β-CD的副产物，二磺烷基化醚为1，4-BS的合成原料，在合成SBE-β-CD时，两者极有可能以4-羟基丁磺酸钠（4-HSS）（结构见图 1-a）、二磺烷基化醚钠（BES）（结构见图 1-b）的形式存在于SBE-β-CD中，由于两者均有潜在的基因毒性风险，为保证产品质量，需要对其进行质量控制。这2种潜在杂质均为烷基磺酸钠盐，属于离子型化合物，且无紫外吸收，不能采用常规的HPLC-UV法进行测定。目前磺酸盐的含量测定方法有紫外分光光度法[8]、离子色谱法[9-12]、两相滴定法[13]、电喷雾质谱法[14-15]等，而对于4-HSS、BES的测定尚未见文献报道。本研究采用高效液相色谱-质谱联用技术，对4-HSS和BES同时进行定量分析，以期为SBE-β-CD的质量控制提供实用、便捷、灵敏的分析方法。
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图 1 4-HSS（a）和BES（b）结构式 Figure 1 Structures of 4-HSS(a)and BES(b) |
Agilent 1260液相色谱仪（美国Agilent公司），配有四元泵、在线脱气机，示差折光检测器（1260 Infinity，美国Agilent公司）；Waters alliance 2695液相色谱仪（美国Waters公司），配有四元泵、在线脱气机，Waters 2420蒸发光散射检测器（ELSD）（美国Waters公司）；3200 QTRAP型串联四极杆线性离子阱质谱仪配有Analyst 1.5.2数据采集、分析软件（美国AB公司）；Agilent 1200液相色谱仪，配有四元泵、在线脱气机、自动进样器（美国Agilent公司）；Inertsil ODS-SP色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；日本GL Sciences株式会社）；TDL-5台式离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；雷磁pH S-25型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。
1.2 试药正戊胺（纯度 > 99%，美国Sigma公司）；四丁基氢氧化铵（分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司）；醋酸铵（色谱纯，美国Dikma公司）；甲醇（色谱纯，J.T Baker）；乙酸（色谱纯，美国Dikma公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；对照品4-HSS、BES（河北医科大学药物化学实验室提供）；SBE-β-CD（批号：20111201、20111202、20111203，由石药集团提供）。
2 方法与结果 2.1 检测条件 2.1.1 色谱条件色谱柱：Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温为30 ℃；流动相：甲醇-10 mmol·L-1正戊胺溶液（用乙酸调节pH至5.5）（30:70）；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL。
2.1.2 质谱条件离子源：电喷雾离子（ESI）源；检测方式：多反应监测（MRM）模式；负离子监测模式：源喷射电压：-4.5 kV；离子源温度：650 ℃；帘气：0.21 MPa；雾化气：0.42 MPa，加热气：0.45 MPa，均为氮气。4-HSS和BES的监测离子对分别为m/z 153.0/79.8和m/z 289.0/152.9；碎裂电压（DP）分别为-36、-50 V；碰撞能量（CE）分别为-34、-29 eV。
2.2 溶液的配制 2.2.1 对照品溶液取4-HSS对照品适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中约含50 ng的溶液，作为4-HSS对照品储备液。精密量取上述溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL中约含5 ng的4-HSS对照品溶液。
取BES对照品适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中约含200 ng的溶液，作为BES对照品储备液。精密量取上述溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL中约含20 ng的BES对照品溶液。
分别取4-HSS和BES对照品储备液各0.5 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，即得混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液取SBE-β-CD供试品约20 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，得2 mg·mL-1的供试品储备液；精密量取上述溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，即得每1 mL中约含0.2 mg的供试品溶液。
2.3 专属性分别取空白溶剂（流动相）、4-HSS对照品溶液、BES对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液进行分析，见图 2。4-HSS与BES的保留时间分别为3.41、4.24 min，空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。
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a. 4-HSS的空白溶剂（blank solvent of 4-HSS）b. BES的空白溶剂（blank solvent of BES）c. 4-HSS对照品（4-HSS reference susstance）d. BES对照品溶液（BES reference susstance）e.混合对照品溶液（mixture of 4-HSS and BES）f.样品中的4-HSS（4-HSS sample）g.样品中的BES（BES in sample） 图 2 多重反应监测色谱图 Figure 2 Multiple-reaction monitoring chromatograms for specificity |
取4-HSS、BES对照品溶液逐级稀释，进行分析，分别以信噪比S/N=3时各对照品的浓度为检测下限，以S/N=10时各对照品的浓度为定量下限。4-HSS、BES的检测下限分别为0.005、0.02 ng·mL-1，定量下限分别为0.01、0.04 ng·mL-1。
2.5 线性关系考察分别取4-HSS、BES对照品储备液适量，制成系列浓度的混合对照品溶液，4-HSS的质量浓度依次为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 ng·mL-1；BES的质量浓度依次为0.4、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ng·mL-1，分别进样。以对照品浓度（X，ng·mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归。4-HSS和BES回归方程分别为：
Y=114.2X+29.60 r=0.999 7
Y=21.68X+18.69 r=0.999 6
表明4-HSS在0.1~5.0 ng·mL-1范围内和BES在0.4~20.0 ng·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验取混合对照品溶液连续进样6次，进行分析，4-HSS与BES峰面积的RSD分别为2.5%、3.5%，表明仪器精密度良好。
2.8 重复性与加样回收率试验平行配制6份供试品溶液（批号：20111203），进样分析，记录峰面积，以标准曲线法计算含量，即为原有量，6份供试品溶液中4-HSS的平均含量为0.000 57%，RSD为3.7%，表明4-HSS的方法重复性良好，由于未能检测到BES，故采用加样供试品测定，结果见加样回收率试验。
取供试品（批号：20111203）约20 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，精密加入4-HSS和BES对照品储备液各2.5 mL，用流动相溶解并稀释至刻度，平行制备6份，分别精密量取上述溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，进行分析，记录峰面积，以标准曲线法计算，即为测得量，根据回收率=（测得量-原有量）/加入量×100%，计算回收率，结果见表 1，并计算BES 6次测定结果的RSD。6份添加对照品的供试品溶液中BES含量测定结果的RSD为4.1%，表明该方法的重复性良好。
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表 1 加样回收率试验结果（n=6） Table 1 Results of recovery test |
精密量取供试品储备液1 mL，置10 mL量瓶中，再精密加入4-HSS和BES对照品储备液各0.25 mL，用流动相稀释至刻度，分别在室温下放置0、4、8和12 h时进样，记录峰面积。与0 h相比，供试品浓度的相对误差（RE）为-4.0%~4.4%，表明供试品溶液在室温下放置12 h基本稳定。
2.9 含量测定取各批供试品，制备供试品溶液，进行分析，记录峰面积，以标准曲线法计算4-HSS和BES的含量。3批供试品中4-HSS的含量依次为0.001 6%、0.001 3%、0.000 57%，BES均低于检测限，满足美国药典4-HSS不大于0.09%，BES不大于0.05%的规定[12]。
3 讨论 3.1 分析方法的选择4-HSS和BES均为烷基磺酸钠盐，无紫外吸收，且在普通反相C18柱上不保留，因此只能选择通用型检测器，如（示差折光检测器、蒸发光散射检测器）和离子色谱法。首先考察了C18柱、季铵盐类离子对试剂、示差折光检测器系统，结果出现消除不掉的倒峰；后又考察了C18柱、挥发性离子对试剂（三乙胺、正戊胺）、蒸发光散射检测器系统，结果出现未知峰，且经常产生基线漂移现象；还曾尝试过HILIC柱，虽与之前方法相比有一定改善，但仍达不到分析要求。最终使用C18柱、挥发性离子对试剂（正戊胺）、LC-MS系统，能够产生保留，且灵敏度较高，因此选择该方法，并做进一步优化。
3.2 质谱条件的选择为获得最佳的质谱条件，4-HSS和BES用流动相溶解后分别注入到质谱仪，在正、负离子模式下进行优化，结果表明2种杂质均在负离子模式下更稳定，响应值更高。然后在Q1模式下优化DP电压，选择响应值最高的峰作为待测物的母离子，在MS2模式下优化CE电压，根据离子的响应值和稳定性，获得最佳定量子离子。
3.3 液相条件的优化4-HSS和BES含有一个相同的离子对（153.0/79.8），同时这一离子对也是4-HSS唯一的定量离子对，因此，在优化色谱条件时需要使两者达到基线分离。在甲醇-水（pH 5.5）（30:70）条件下，考察了不同离子对试剂浓度（2、5、10 mmol·L-1）时2种杂质的分离度，结果显示正戊胺浓度为2 mmol·L-1时样品不保留，浓度为5 mmol·L-1时2种杂质未完全分离，浓度为10 mmol·L-1时2种杂质完全分离，且峰形较好，因此选择正戊胺的浓度为10 mmol·L-1。在甲醇-10 mmol·L-1正戊胺溶液（30:70）条件下，用乙酸调节pH，考察了不同pH（5.5、5.0、4.5、4.0）对响应值的影响，结果表明随着pH的降低，分析物的响应值降低，故选择pH 5.5。研究发现，pH在6.0~9.0范围内pH变化较快，溶液不容易配制，且平行性差，故仅考察到pH 5.5，在此条件下灵敏度和分离度均能满足测定要求。
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