2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
药品杂质限度控制是药物质量标准研究的重要内容[1]。近年来，国际上对药物杂质的遗传毒性越来越重视，EMA、美国FDA等先后颁布了遗传毒性杂质控制的指导原则[2-4]，2014年，ICH发布了M7指导原则：为控制潜在的致癌风险的DNA反应性（致突变性）药物杂质的评价和控制，对具有DNA反应性性（致突变性）的杂质控制提出了通用的要求，目前已在各成员国药品注册中使用[5]。
5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF），是葡萄糖、果糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的1个醛类化合物[6]。根据国家药典会的研究项目安排，本实验室按照ICH M7指导原则的要求，采用（定量）构效关系计算机模型[（Q）SAR，或in silico]技术，对HMF进行了遗传毒性预测。同时，本文汇总了中国药典2015年版中收载HMF作为杂质的药物标准，对其检测方法、含量限度等进行分析，并结合遗传毒性杂质评价和控制的要求，对其标准合理性进行分析。
1 中国药典2015年版对HMF进行控制的品种及方法情况中国药典2015年版一部收载的蜂蜜标准和中国药典2015年版二部收载的20个品种标准对HMF进行了控制。HMF检测方法包括紫外分光光度法、高效液相色谱法（HPLC），还有个别产品为颜色反应。HPLC法限度大多规定不高于葡萄糖含量的0.02%，紫外法只是规定在一定浓度时吸光度不超过规定限值。品种、检测方法、及限度规定见表 1。
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表 1 中国药典2015年版控制HMF的品种、检测方法及限度规定情况 Table 1 Drugs contain HMF as an impurity and the test methods and limits for HMF |
版本：Derek Nexus：5.0.1，数据库（Know -ledge）：Derek KB 2015 1.0，数据库版本：1.0，数据库日期：2015年12月7日，英国Lhasa公司研制（http://www.lhasalimited，org/）。
Derek是经典的毒理学预测软件，可以对包括遗传毒性、致癌性等在内的59个毒理学预测终点进行评价，并提供触发的警戒结构信息。Derek作为基于专家知识的评价系统用于杂质遗传毒性预测，在EMA、美国FDA相关指导原则中均为被推荐的软件之一。Derek用于杂质致突变性预测，基本设置为：物种设为细菌，预测终点设置为遗传毒性项下的致突变性。
2.1.2 Sarah版本：Sarah Nexus：2.0.1，模型：Sarah Model 1.1.19，模型版本：2.0.1。英国Lhasa公司研制（http://www.lhasalimited，org/）。
Sarah是基于统计的QSAR软件，主要是配合专家知识规则的软件，对药物杂质的致突变性进行预测。
2.1.3 Nexus版本Nexus：2.1.0，英国Lhasa公司（http://www.lhasalimited，org/）旗下Derek、Sarah、Vitic、Meteor、Zeneth等软件整合的平台。
在Nexus系统中，使用Derek和Sarah进行遗传毒性评价，可以分别使用2个软件。同时，Nexus系统中已固化了组合的ICH M7模式（ICH M7 Prediction），并能够采用ICH M7分类模式（ICH M7 Batch Classification）对杂质基因毒性进行预测和分类。
2.2 评价方法和结果 2.2.1 评价方法采用Chemdraw 12.0绘制药物活性成分（API）及杂质的化学结构图，分别为葡萄糖、果糖、HMF（见图 1），输入Nexus 2.1（整合了Derek和Sarah等软件的综合软件）。采用ICH M7模式和ICH M7分类模式，对HMF进行遗传毒性预测。
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图 1 葡萄糖、果糖和5-羟甲基糠醛结构式 Figure 1 Structures of glucose, fructose and HMF |
评价结果综合于表 2中。
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表 2 HMF遗传毒性[Q]SAR预测结果 Table 2 [Q]SAR prediction summary of the genotoxicity of HMF |
HMF Derek和Sarah预测结果均为阳性，无论以葡萄糖还是以果糖作为API，ICH M7分类均为2类。HMF Derek预测触发的警戒结构为574呋喃。在Sarah预测时，基于数据库中化合物结构精确匹配（已有文献资料）及表 3中所列1个支持性结构，HMF基因毒性阳性的可信度为100%，提示Sarah预测时在数据库中检索到直接证明本品为阳性的文献资料。
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表 3 HMF Sarah阳性预测详细信息 Table 3 Sarah prediction details for the positive result of HMF |
为了考察HMF标准中吸收度与实际含量的关系，利用HMF标准物质（批号：111626-201509，含量97.8%，购自中国食品药品检定研究院），分别采用水和1%葡萄糖注射液作为溶剂，考察吸收度与含量的关系[9]。所用仪器：UV-2600紫外分光光度计（岛津公司），检测波长284 nm。结果见表 4。
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表 4 HMF浓度与吸收度关系 Table 4 The corresponding absorbance value and concentration of HMF |
由表 4可见，1%葡萄糖不干扰HMF的检出。在以1%葡萄糖为溶剂时，以HMF浓度（Y，μg·mL-1）对吸收度（X）制作回归方程：
Y=2.253X-0.006 2 r=0.999 8
葡萄糖注射液检查时吸收度0.32对应的HMF质量浓度约为0.7 μg·mL-1，对应5%葡萄糖注射液限度为3.5 μg·mL-1，10%葡萄糖注射液限度为7 μg·mL-1。如每日葡萄糖注射液用量为500 mL，日暴露量分别为1.75和3.5 mg。
同理，右旋糖酐20、40、70葡萄糖注射液，如每日用量为500 mL，HMF暴露量也为1.75 mg。
3.2 以葡萄糖注射液为载体的制剂中HMF的暴露量按照临床用法用量，以葡萄糖注射液为载体的制剂大多每日最大用量为500 mL，合葡萄糖量为25 g，如果按葡萄糖标示量的0.02%计算，则HMF每日暴露量可达5 mg。
3.3 蜂蜜中HMF暴露量蜂蜜每日用量为15~30 g，因此，每日最大可能暴露量为1.2 mg。
4 讨论ICH M7指导原则最显著的特点之一是引入了（Q）SAR评价的概念。不同于EMA和美国FDA以前对于遗传毒性杂质评价的要求，ICH M7要求使用两类互补的（Q）SAR评价体系，一类是基于专家知识规则的，另一类是基于统计学的。如果2个互补的（Q）SAR评价体系均没有发现警戒结构（评价结果为阴性），则足以得出结论该杂质没有遗传毒性，不需要进一步检测。ICH M7目前是唯一的将（Q）SAR评价结果作为以注册为目的的申报资料的最终结论的法规性文件。已有研究对包括Derek、Sarah等软件组合的预测效果进行评价[10-11]，Derek和Sarah的组合符合OECD的认证体系，并为美国FDA等认可。
根据杂质的诱变性和致癌性以及其应控制的措施，ICH M7指导原则将药物杂质分为5类，其中1、2、3类需按照遗传毒性杂质进行严格控制。
对于遗传毒性杂质的控制，M7指导原则引入了毒理学关注阈值（a threshold of toxicological concern，TTC）的概念。1个具有遗传毒性的杂质，每人每天摄入1.5 μg时其风险被认为可以忽略（终生暴露的情况下理论的患癌风险小于十万分之一）[12]。一般长期用药（≥10年）的药物遗传毒性杂质，且无致癌试验数据（2类和3类），可以采用TTC作为默认的可以接受的标准。如果药物使用周期短于生命周期（less-than-lifetime，LTL），可以适当调整TTC的限度。
根据TTC计算遗传毒性杂质限度公式如下：
| $ {\rm{杂质限度}}\left( {{\rm{ \mathsf{ μ} g}} \cdot {{\rm{g}}^{ - 1}}} \right) = \frac{{{\rm{TTC}}\left( {1.5\;{\rm{ \mathsf{ μ} g}} \cdot {{\rm{d}}^{ - 1}}} \right)}}{{{\rm{每日剂量}}\left( {{\rm{g}} \cdot {{\rm{d}}^{ - 1}}} \right)}} $ |
另外，如有致癌性试验数据，可根据化合物特定的风险评估计算其可接受摄入量（acceptable intakes，AIs）。如对于阳性致癌数据的杂质，可以采用TD50线性外推法计算可接受摄入量；对于有实际阈值证据的遗传毒性杂质，可以根据其阈值计算日允许暴露量（permissible daily exposures，PDEs）等。2015年，ICH颁布了M7指导原则的增补，对于15个（类）遗传毒性或致癌性明确的化合物进行了允许摄入量或日允许暴露量的计算和规定[13]。
由于HMF具有一定的毒性，在相关药品标准中得到了关注和控制。也有研究表明，HMF具有遗传毒性和致癌性。虽然相关致癌性证据并不充分，但可以肯定，HMF具有致突变性[14-15]。按照ICH M7指导原则，采用基于知识规则和基于统计学的两类（Q）SAR软件进行评价，HMF属于2类遗传毒性杂质。本品限度的制定需按照遗传毒性杂质要求进行。最理想的限度HMF的日暴露量为1.5 μg·d-1。
根据上文中暴露量的评估，药典标准对HMF的限度规定，大多数远远超过TTC限度的要求，存在较大安全隐患，因此，建议修改相关质量标准。例如，以5%葡萄糖注射液和以5%葡萄糖注射液为溶剂的制剂，按每日用量500 mL计算，限度应为0.06 μg·g-1（以葡萄糖计）。当然，过于严格的标准必定会带来生产工艺的难度和生产成本的增加，由于TTC是一个高度保守的暴露量，可以根据临床用药周期等进行调整，或者通过实验研究，提供充分的实验证据，以求得HMF的安全暴露量。
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