2. 江西中医药大学药学院, 南昌 330004
2. Department of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China
叶黄素是含有多个不饱和氢键的天然类胡萝卜素,抗氧化能力强,在老年性黄斑退化病和白内障疾病防治方面有重要作用[1-2],能够增强体液免疫,刺激淋巴细胞增殖和预防心血管疾病等生理功能[3-4],叶黄素还可以通过滤过蓝光和抗氧化作用保护皮肤、视网膜和体内多个组织免受氧化损伤,具有保护视力的功能[5-7]。但叶黄素的碳链较长且含有多个疏水基,不溶于水,易受光、氧、高温等因素的影响发生降解而失活。此特性严重制约叶黄素的吸收和进入体内到达有效部位,同时也极大影响它在食品和医药领域的应用。
脂质体是由磷脂分散在水中自聚集形成的具有双分子层结构的纳米粒子,对内容物起保护和缓释作用[8-9]。通过纳米脂质体的载体作用可将叶黄素包裹在类脂双分子层内,可有效地保护叶黄素分子中的功能性羟基和不饱和氢键不受光热的破坏,并改善叶黄素的水不溶性,提高其在水中的溶解性和稳定性;脂质体具有类细胞结构,改变包封药物的体内分布,提高药物的吸收效果和生物利用度,从而减少药物的治疗剂量。本文采用传统的薄膜分散-超声法制备叶黄素脂质体,应用高效液相色谱法,初步建立了叶黄素脂质体的质量控制标准和含量测定,以期为进一步研究叶黄素脂质体药品提供实验依据。结果表明,本实验方法操作简单快捷,重复性良好,结果准确可靠,达到了对叶黄素成分分析检测的目的。
1 仪器和试药 1.1 仪器Waters高效液相色谱仪,自动进样器,Waters 1525二元泵,Waters 2487紫外检测器,恒温柱温箱,Diamonsil(2)C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)色谱柱(填料为十八烷基硅烷键合硅胶,迪马科技有限公司);超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司),电子天平(百万分之一,梅特列-托利多仪器有限公司),旋转蒸发器(上海申生科技有限公司),超声波细胞粉碎机(宁波新芝科技股份有限公司)。
1.2 试药对照品叶黄素(99.5%,CATO公司,批号20161011-00004);叶黄素原料药(浙江海宁凤鸣叶绿素有限公司,批号20160331);胆固醇(阿拉丁试剂有限公司);大豆磷脂(上海太伟药业有限公司,批号201604022,磷脂酰胆碱(PC)≥75.9%);乙腈、甲醇、乙酸乙酯为色谱纯,PBS缓冲液自制,水为注射用水。
2 叶黄素脂质体的制备精密称取卵磷脂306.6 mg、胆固醇59.5 mg和适量的叶黄素,置于250 mL圆底烧瓶中,加入30 mL氯仿超声至完全溶解,置旋转蒸发仪中(真空度为0.045 MPa、水浴温度50 ℃),旋转蒸发2 h除去氯仿,在圆底烧瓶上形成均匀薄膜,加入40 mL水化介质0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS,pH 6.8),继续旋转蒸发2 h,迅速冷却,冰浴超声处理(超声时间2 min,超声功率350 W,脉冲3 s/3 s),分别用0.45、0.22 μm微孔滤膜各过滤3次,得到的叶黄素脂质体溶液在4 ℃下保存。
3 方法与结果 3.1 色谱条件色谱柱:Diamonsil(2)C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相:100%纯乙腈;流速:0.6 ml·min-1;检测波长:443 nm;柱温:25 ℃;进样量:20 μL。在以上色谱条件下。叶黄素峰的理论塔板数为10 000以上,分离度大于1.5。
3.2 溶液的配制 3.2.1 对照品溶液避光操作,精密称取叶黄素对照品4.37 mg,置于25 mL量瓶中,用约1 mL乙酸乙酯溶解,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
3.2.2 供试品溶液避光操作。精密量取叶黄素脂质体5 mL置于10 mL量瓶中,加入约4 mL的甲醇破乳,超声处理(功率180 W,时间2 min),用甲醇定容至刻度,摇匀,即得。
3.2.3 阴性样品溶液按处方比例称取磷脂、胆固醇,按照“2”项下方法制备不加入叶黄素的空白脂质体,甲醇破乳,并定容于10 mL量瓶中,得到阴性样品溶液。
3.3 方法学考察 3.3.1 系统耐用性试验取“3.2.2”项下供试品溶液,分别用同品牌同型号不同批号色谱柱、不同流速(0.5、0.6、0.7 mL·min-1)按“3.1”项下色谱条件检测,结果主峰与有关物质(杂质)分离度均大于1.5,理论塔板数均大于10 000,表明系统的耐用性良好。色谱图见图 1。
移取5 mL供试品色谱溶液置于25 mL量瓶中,共5份。分别使用365 nm紫外灯、60 ℃水浴、3%双氧水溶液、0.1 mol·L-1盐酸溶液和0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液破坏样品4 h,分别移取这5份破坏后的供试品溶液和阴性样品溶液进样,按“3.1”项下色谱条件测定,结果在样品色谱中叶黄素与相应的对照品的色谱峰保留时间一致,达到基线分离,配方中其他成分和有关物质(杂质)对测定无干扰,表明该色谱条件专属性较好,能够适用于样品的检测要求,色谱图见图 1。
3.3.3 线性关系考察分别精密移取0.4、0.8、1.6、2.4、3.0、4.0 mL上述对照品溶液置10 mL棕色量瓶中,用甲醇定容。用微孔滤膜过滤后,按“3.1”项下色谱条件进样。以叶黄素峰面积(Y)为纵坐标,溶液质量浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线,得到回归方程(n=6):
Y=1.058×105X-4.086×105 r=0.999 8
结果表明叶黄素在质量浓度在6.96~69.57μg·mL-1范围内线性关系良好。
3.3.4 精密度试验取“3.2.1”项对照品溶液,按“3.1”项下色谱条件连续进样6次,记录色谱图。结果叶黄素峰面积的RSD为0.48%,表明色谱系统的精密度良好。
3.3.5 定量下限测定将对照品溶液稀释成一系列的浓度,在“3.1”项下色谱条件依次进样,测定峰面积值,以基线噪声10倍峰面积对应的浓度为定量下限。结果叶黄素的定量下限为1.12 μg·mL-1。
3.3.6 重复性试验取适量叶黄素脂质体,按照“3.2.2”项下方法制备6份供试品溶液,分别进样,测定峰面积。叶黄素平均含量为3.171 7 μg·mL-1,RSD为0.61%,表明该方法的重复性良好。
3.3.7 稳定性试验取同一批供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、12 h依次进样,测定峰面积,其RSD为0.70%,结果表明供试品溶液稳定性良好。
3.3.8 加样回收率试验避光操作、精密称取叶黄素原料药13.30 mg,置于50 mL量瓶中,加约1 mL乙酸乙酯溶解,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得叶黄素甲醇液。取空白脂质体悬浮液5 mL于25 mL量瓶中,加入叶黄素甲醇溶液5mL,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得储备液。取储备液1.2、1.5、1.8 mL,各3份,分别加入对照品溶液0.65、0.8、0.95 mL,用甲醇定容至10 mL。按“3.1”项下色谱条件分别进样,计算回收率。结果叶黄素脂质体的平均加样回收率为98.8%,RSD为1.8%,见表 2。
按照“2”项下方法制备叶黄素脂质体3批(20170118-1、20170118-2、21070118-3),按照建立的HPLC方法进行分析,记录色谱图,以叶黄素峰面积按外标法计算3批样品的含量。结果3批样品的含量分别为98.61%、96.17%、100.51%,RSD为1.4%。
4 讨论 4.1 流动相的确定本实验参考文献内容,曾选用甲醇-水[10]、乙腈-甲醇[11]、乙腈-甲醇-乙酸乙酯[12]和100%乙腈[13]等体系为流动相,流速1.0 mL·min-1,多次试验后发现甲醇-水体系为流动相,叶黄素与杂质不能基线分离;乙腈-甲醇体系为流动相,叶黄素与杂质不能较好地分离,有拖尾现象发生,峰形较差;乙腈-甲醇-乙酸乙酯体系为流动相,叶黄素与杂质能实现基线分离,但叶黄素的出峰时间太早,与溶剂峰重合;100%乙腈体系为流动相,叶黄素与杂质不能较好地分离,降低流速后发现峰形较为理想,分离度 > 1.5。故本实验采用“3.1”项下流动相进行分析。
4.2 叶黄素的稳定性叶黄素含有多个不饱和双键和2个紫罗酮环二羟基,易被氧化。在实验过程中发现,对叶黄素样品进行日间精密度分析时,第3天的样品溶液中叶黄素的含量降为原来的76.83%。故对照品溶液和供试品溶液需现配现用,同时制备后应该及时测定以免影响实验结果。本实验考察配制的供试品溶液至少在12 h内稳定,满足测定要求。
4.3 结论本文建立的反相高效液相色谱法操作简便快捷,耐用性、专属性、重复性和回收率均符合要求,能用于测定叶黄素脂质体中叶黄素成分的含量。
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